丙型肝炎病毒F蛋白研究新进展

丙型肝炎病毒(HCV)基因组长度约9.6kb,仅含有单个开放阅读框架(ORF),编码一个由约3010个氨基酸残基(aa)组成的多蛋白.在宿主细胞和病毒蛋白酶的作用下,多蛋白被加工成至少10个成熟的HCV蛋白质:C,E1,E2,p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B.HCV C蛋白由191个aa组成,相对分子质量为23000,称为p23蛋白.p23羧基端aa被蛋白酶降解,就得到相对分子质量为21000的成熟C蛋白,称为p21蛋白.p21是HCV的重要结构蛋白,它与HCV RNA结合后形成病毒核心.Xu等[1]证实HCV C基因还可以编码产生一个新的蛋白--F蛋白.近年来F蛋白成为HCV研究的热点之一.     

丙型肝炎病毒F蛋白研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内慢性肝炎的主要病原，约有1．7亿人被感染，常导致严重肝病，包括肝硬化和肝细胞癌(HCC)。HCV是1989年Choo等^[1]应用分子生物学技术克隆成功的一个RNA病毒，属黄病毒科，基因组为正链RNA，长度约为9．6kb，该病毒的基因组含有一个长的开放阅读框架(ORF)，编码一个约3010个氨基酸残基(aa)组成的多蛋白，该多蛋白被细胞和病毒蛋白酶切割产生至少10个病毒基因产     

慢性丙型肝炎患者病毒血清抗体的分型

不同地区分离的ＨＣＶ分属不同的基因型，对治疗的反应有较大的差异，检测病毒类型应对丙肝的临床预后有较大的帮助．但基因分型方法复杂，技术要求高，价格昂贵，不便于临床应用．血清抗体分型方法简便，能部分地反映ＨＣＶ的分型情况．我们对８３例ＣＨＣ患者进行了ＨＣＶ血清抗体的检测，旨在了解在ＣＨＣ中不同血清型的分布，及与患者预后的关系．１　材料和方法１．１　材料　１９９４０４／１９９７０８我院收治的ＣＨＣ８３例，男５３例，女３０例，平均年龄４５岁±１２岁．按１９９５年北京会议病毒性肝炎诊断标准，其中轻度３…     

丙型肝炎病毒C区部分基因的克隆表达及抗原性

目的 研究丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）不同长度Ｃ蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化及其抗原性。方法 应用核酸及蛋白分析软件对Ｃ蛋白的抗原决定簇预测分析,以ＰＣＲ方法扩增３段长度分别为２０１ｂｐ,４０２ｂｐ及５９１ｂ;ｐ的Ｃ基因片段,通过基因体外重组技术克隆到ｐＧＥＸ－３Ｘ表达质粒中,用所获重组蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠并应用ＥＬＩＳＡ法对银川市动物系列稀释血清进行抗体测定和     

丙型肝炎病毒NS3蛋白人源基因工程单链抗体的表达

目的在大肠杆菌XL1-Blue中表达可溶性的抗HCV非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体（single-chainvariablefragmentantibody,ScFv）。方法以重组的HCVNS3为抗原,利用噬菌体抗体库技术筛选含有抗-HCVNS3ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经SfiI/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠杆菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）诱导表达HCVNS3可溶性单链可变区抗体。ELISA和斑点吸印杂交检测其与不同来源的抗原的结合活性。结果筛选到的HCVNS3的单链抗体基因,经限制性内切酶酶切和序列分析表明,该抗体基因由750bp组成,ELISA和斑点吸印杂交结果表明,在大肠杆菌XL1-Blue中表达的HCVNS3的单链抗体,可与不同来源的NS3抗原结合。结论大肠杆菌XL1-Blue表达的NS3-ScFv具有结合不同来源的HCVNS3的活性和特异性。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功.     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

丙型肝炎病毒F蛋白克隆表达及其抗原性

目的 在原核表达系统中诱导表达1b型HCV F蛋白及Core蛋白,建立F抗体ELISA检测方法,对F蛋白在慢性丙型肝炎患者体内的抗原性作相关研究.方法 应用RT-PCR方法从HCV感染者血清中获得Core蛋白编码基因,在第42位和144位人工增加或减少1个核苷酸,使其读码框移位,利用多重PCR技术拼接获得全长F蛋白的基因序列,分别构建编码F和Core蛋白的重组质粒.将鉴定正确的重组质粒转人大肠埃希菌BL21中,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达HCV Core和F蛋白.应用镍离子亲和层析树脂纯化蛋白,并用Western印迹法鉴定其免疫原性.建立ELISA检测方法对121例慢性丙型肝炎患者血清巾抗F蛋白抗体进行检测.结果 成功构建含HCV F蛋白、Core蛋白编码基因的重组克隆,表达纯化获得的HCV F蛋白和Core蛋白,Western印迹法鉴定并确定其特异性.121例慢性丙型肝炎患者血清巾抗Core和抗F抗体的阳性率分别是93%和65%,而40例HBV感染者和40例健康对照者血清反应阴性.结论 F蛋白在HCV自然感染中有表达,并能产生特异的免疫反应,其生物学功能及在HCV感染过程中的作用有待进一步研究.     

丙型肝炎病毒RNA聚合酶可溶性和抗原性的研究

目的在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶,研究其可溶性的条件,进一步研究它的抗原性,为研究其活性打下基础。方法构建表达载体 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１。在 Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）菌株中表达。在不同诱导条件下分析其可溶性,在获得ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１可溶性蛋白后,通过Ｎｉ－ＮＴＡ柱纯化。纯化后得到的目的蛋白进行ＥＬＩＳＡ和 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果在 Ｅ．ｃｏｌｉ中表达了 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△ Ｃ２１重组蛋白,二者在 ３７℃诱导条件下均以包涵体形式存在,ｐＱＥ－５Ｂ－△２１重组蛋白在１８℃诱导条件下５０％以可溶形式存在,通过ＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析,表明该蛋白具有抗原性。结论在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达的ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶有良好的可溶性及抗原性。     

Screening of hepatocyte proteins binding to F protein of hepatitis C virus by yeast two-hybrid system

AIM: To investigate the biological function of F protein by yeast two-hybrid system. METHODS: We constructed F protein bait plasmid by cloning the gene of F protein into pGBKT7, then recombinant plasmid DNA was transformed into yeast AH109 (a type). The transformed yeast AH 109 was mated with yeast Y187 (a type) containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing plasmids from positive (blue) colonies, we underwent sequence analysis by bioinformatics. RESULTS: Thirty-six colonies were selected and sequenced. Among them, 11 colonies were zymogen granule protein, 5 colonies were zinc finger protein, 4 colonies were zinc-α-2-glycoprotein, 1 colony was sialyltransferase, 1 colony was complement control protein factor I, 1 colony was vitronectin, and 2 colonies were new genes with unknown function. CONCLUSION: The yeast two-hybrid system is an effective method for identifying hepatocyte proteins interacting with F protein of hepatitis C virus. F protein may bind to different proteins.     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

国产某丙型肝炎病毒抗体试剂中吸光度/临界值的作用

目的研究某国产抗-HCV试剂样本吸光度／临界值（S／Co）的意义，探讨国产试剂检测抗-HCV的初步程序和标准。方法采用某国产试剂通过ELISA法检测295000例无偿献血者的抗-HCV，对其阳性反应的样本采用Ortho抗-HCV试剂通过ELISA法进行检测。Ortho试剂阳性反应的样本进行HCV重组免疫印迹实验（RIBA），并对其中的106例Ortho试剂阳性反应的样本进行核酸检测。结果在295000例样本中，某国产试剂抗-HCV阳性反应为681例，阳性率为0．23％。某国产试剂阳性反应的样本经Ortho试剂检测后阳性反应为367例，符合率为53．8％，其中Ortho试剂S／Co值≥3．8为66．2％。在Ortho试剂S／Co值≥3．8的样本中，某国产试剂S／Co值≥8．0的占94．2％；而Ortho试剂S／Co值〈3．8的样本中，某国产试剂S／Co值〈8．0的占99．2％。367例Ortho阳性反应样本中，RIBAHCV阳性223例，阳性率为60．8％；在国产试剂S／Co值≥8．0的样本中，RIBA阳性率为95．7％；而同一种国产试剂S／Co值〈8．0的样本中，RIBA阳性率为2．2％。106例Ortho试剂阳性反应样本中核酸检测阳性为42例。结论国产抗-HCV试剂在检测无偿献血者样本中存在较高的假阳性率，一定程度上造成了血源和血液的浪费。某国产试剂S／Co值≥8.0和Ortho试剂S／Co值≥3．8具有一定的相关性，在实验室检测抗-HCV上具有一定诊断价值。     

合并乙型肝炎病毒感染对丙型肝炎病毒核心抗原检测的影响

目的 探讨合并HBV感染对慢性HCV感染者血清丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)检出情况的影响. 方法 收集2005年12月-2009年10月慢性丙型肝炎患者和HBV/HCV合并感染者资料,检测血清HCVcAg和HCV RNA,对后者血清进行HBV DNA、HBeAg检测,分析HCVcAg检出率与HBeAg、HBV DNA定量检测的关系.用独立两组多分类的X2检验方法进行统计学分析. 结果 共收集88例慢性丙型肝炎患者和62例HBV/HCV合并感染者资料,血清HCVcAg的检出率分别为72.7％(64/88)和38.7％ (24/62),两者比较,x2= 17.358,P＜0.01,差异有统计学意义.HCV RNA检出率分别为81.8％ (72/88)和53.2％ (33/62),两者比较,x2=20.110,P＜0.01,差异有统计学意义.62例HBV/HCV合并感染者血清中,HBeAg阳性和HBeAg阴性感染者HCVcAg检出率分别为28.6％ (12/42)和60.0％ (12/20),两者比较,x2=5.641,P=0.011,差异有统计学意义.HCV RNA阳性率分别为42.9％ (18/42)和80.0％ (16/20),两者比较,X2=7.547,P＜ 0.01,差异有统计学意义.HBV DNA阳性和阴性时HCVcAg检出率分别为39.1％ (18/46)和37.5％ (6/16),两者比较,P＞0.05,差异无统计学意义.与单纯HCV感染者血清HCVcAg检出率72.7％ (64/88)比较,HBeAg阴性合并感染者为60.0％ (12/20),x2=1.266,P=0.261,差异无统计学意义;HBV DNA阴性合并感染者为37.5％ (6/16),x2=7.635,P＜0.01,差异有统计学意义.结论 HBV/HCV合并感染时HCVcAg检出率较低,可能是由于HBeAg抑制HCV的复制,从而减少HCVcAg的表达所致.     

HDV感染后乙型肝炎患者血清肝炎病毒标志物的变化

目的　分析HDV感染患者血清病毒性肝炎标志物的变化和意义 ,探讨HDV致病机理。方法　对 469例HDV阳性乙型肝炎患者常见各类型病毒性肝炎血清标志物的变化等作统计分析 ,以 2 13例HDV( -)乙型肝炎患者作对照。结果　HDV感染后血清HBeAg检出率降低 (P <0 .0 1)。在HDV ( +)HBVDNA( -)组 ,HBeAg( -)的机会大 (P <0 .0 1)。在急性肝炎、重型肝炎和肝硬化患者HDAg( +)HBeAg( -)为主要血清病毒表现形式 (P <0 .0 1或 0 .0 5 )。HDV感染后合并其它肝炎病毒感染率高于乙型肝炎组。结论　HDV感染可抑制HBV复制或HBeAg表达 ,混合感染HDV的乙型肝炎中HDV的直接细胞毒性作用可能起主要致病作用。重叠感染HDV的乙型肝炎患者其病情重、病死率高和容易慢性化。     

Low prevalence of hepatitis B and hepatitis C virus serum markers in a cohort of pregnant women from Southern Italy

BackgroundMother-to-child transmission is still considered a major factor in the spread of hepatitis viruses. Nevertheless, epidemiological data on hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV) in reproductive-age women are limited even in areas like the South of Italy where both viruses had been widespread.AimThe aim of this study was to investigate the prevalence of HBV and HCV serum markers in a large cohort of pregnant women from Southern Italy.MethodsData concerning 7558 pregnant women consecutively admitted to an Obstetric Division of a Sicilian University Hospital over a six-year period (January 2010–December 2015) were retrospectively collected from clinical notes.ResultsPositivity for both HBV s-antigen (HBsAg) and antibodies to HCV (anti- HCV) was very low (0.5% and 0.2%, respectively). HBsAg prevalence was significantly higher in non-Italian than in Italian women (p < 0.001). On the contrary, all the anti-HCV positive cases were of Italian origin. Age was not significantly different between positive and negative women.ConclusionThese results confirm the dramatic decline of HBV and HCV prevalence that recently occurred in Southern Italy, and highlight the importance and cost-effectiveness of systematic HBV and HCV screening in childbearing age women in order to properly apply the available preventive measures and definitively eliminate the risk of vertical transmission for both viruses.     

丙型肝炎病毒核心蛋白、Bcl-2、P21Waf1在丙型肝炎中的表达及相互关系

目的　调查丙型肝炎、肝硬化病人组织中的丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白、P2 1、Bcl 2的表达以及相互间关系 ,探讨HCV核心蛋白是否抑制P2 1和促进Bcl 2表达。方法　收集 2 3例HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织 ,采用免疫组化Envision法检测核心蛋白、P2 1、Bcl 2表达 ,并用统计学方法分析三者间的表达关系。结果　HCV核心蛋白和突变P2 1的阳性表达主要位于细胞核中 ,Bcl 2的阳性表达主要位于细胞质 ;HCV核心蛋白表达阳性组织中 ,P2 1阳性表达率仅 13 % ,Bcl 2阳性表达率则达 95 .7% ,三组间比较差异有显著性 (P =0 .0 12 )。HCV核心蛋白和Bcl 2二组间比较差异无显著性 (P =0 .5 61) ;HCV核心蛋白与Bcl 2、p2 1阳性强度两者间P值分别为 0 .0 12和 0 .2。结论　三种蛋白的表达有相关性 ,HCV核心蛋白可能促进Bcl 2蛋白的表达 ,抑制P2 1蛋白表达     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因共表达对血管内皮细胞生长因子的影响

目的建立乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因（HBV X—HCV C）共表达HepG2细胞模型，并探讨其对血管内皮细胞生长因子表达的影响。方法双酶切质粒pXT1—X，得到完整的HBV X基因片段后，将其插入到质粒PBK—CMV和PBK—HCV C的相应酶切位点，得到重组质粒PBK—X和PBK—X—C；再将质粒PBK—CMV、PBK—X、PBK—HCV C和PBK—X—C分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，逆转录聚合酶链反应、Western blot鉴定HBV X和HCV C蛋白表达，免疫组织化学、Western blot检测血管内皮细胞生长因子蛋白质表达。结果质粒PBK—CMV、PBK—X、PBK—HCV C和PBK—X—C在HepG2细胞中有稳定表达。共表达HBV X—HCV C蛋白的细胞血管内皮细胞生长因子蛋白质表达较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高。结论HBV X—HCV C共表达能显著上调血管内皮细胞生长因子蛋白质表达，提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用。     

Hepatitis C virus inhibitor synergism suggests multistep interactions between heat-shock protein 90 and hepatitis C virus replication

AIM: To address the effect of heat-shock protein 90(HSP90) inhibitors on the release of the hepatitis C virus(HCV), a cell culture-derived HCV(JFH1/HCVcc) from Huh-7 cells was examined.METHODS: We quantified both the intracellular and extracellular(culture medium) levels of the components(RNA and core) of JFH-1/HCVcc. The intracellular HCV RNA and core levels were determined after the JFH1/HCVcc-infected Huh-7 cells were treated with radicicol for 36 h. The extracellular HCV RNA and core protein levels were determined from the medium of the last 24 h of radicicol treatment. To determine the possible role of the HSP90 inhibitor in HCV release, we examined the effect of a combined application of low doses of the HSP90 inhibitor radicicol and the RNA replication inhibitors cyclosporin A(Cs A) or interferon. Finally, we statistically examined the combined effect of radicicoland Cs A using the combination index(CI) and graphical representation proposed by Chou and Talalay.RESULTS: We found that the HSP90 inhibitors had greater inhibitory effects on the HCV RNA and core protein levels measured in the medium than inside the cells. This inhibitory effect was observed in the presence of a low level of a known RNA replication inhibitor(Cs A or interferon-α). Treating the cells with a combination of radicicol and cyclosporin A for 24 h resulted in significant synergy(CI 1) that affected the release of both the viral RNA and the core protein. CONCLUSION: In addition to having an inhibitory effect on RNA replication, HSP90 inhibitors may interfere with an HCV replication step that occurs after the synthesis of viral RNA, such as assembly and release.