NiCl2诱导人支气管上皮细胞系恶性转化的研究

目的 建立NiCl2诱导永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiCl2诱导16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒，每隔20d染毒1次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成试验和裸鼠体内致瘤试验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiCl2多次处理，16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量一反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论NiCl2具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

石英诱发人支气管上皮细胞恶性转化模型的建立

目的 研究石英诱发永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化作用.方法 用新研磨的浓度为300 mg/L的石英染毒16HBE细胞共10次,软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验鉴定转化细胞的恶性程度.结果 细胞培养至35代,发现石英可以诱导16HBE发生恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01);转化细胞在裸鼠体内成瘤.结论 石英具有较强的诱导16HBE恶性转化能力.     

人支气管上皮细胞体外转化试验的研究进展

细胞转化试验是研究各种理化因素致癌机制的有效方法。与其它细胞转化试验相比,人支气管上皮细胞恶性转化试验克服了种属和组织学差异,可以在体外条件下模拟体内细胞受致癌原作用后向肿瘤细胞演变的过程,在细胞水平观察到典型的恶性转化表型,在分子水平研究致癌因素的作用机制,为癌变分子机制的研究提供了良好的模型,也为外来化学物质的致癌性检测提供了新的有效途径。     

068 人支气管上皮细胞体外转化试验的研究进展

细胞转化试验是研究各种理化因素致癌机制的有效方法.与其它细胞转化试验相比,人支气管上皮细胞恶性转化试验克服了种属和组织学差异,可以在体外条件下模拟体内细胞受致癌原作用后向肿瘤细胞演变的过程,在细胞水平观察到典型的恶性转化表型,在分子水平研究致癌因素的作用机制,为癌变分子机制的研究提供了良好的模型,也为外来化学物质的致癌性检测提供了新的有效途径.     

氯化镉诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的研究氯化镉诱发SV40 LargeT抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用。方法体外用不同浓度氯化镉多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度。结果细胞培养至35代,发现氯化镉可诱导16HBE恶性转化。转化细胞排列紊乱、重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01),并呈时间—剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论氯化镉有较强的诱导16HBE恶性转化能力;该转化模型为镉致癌机制的分子水平提供了理想的研究系统。     

亚砷酸钠致人支气管上皮细胞恶性转化过程中氧化应激指标变化

目的探讨在亚砷酸盐致人支气管上皮(HBE)细胞恶性转化过程中氧化应激指标的变化趋势,初步探讨其对细胞恶性转化的作用。方法用1μmol/L亚砷酸钠连续染毒HBE细胞。通过形态学观察、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)以及软琼脂克隆实验鉴定细胞恶性转化情况,分别于暴露1、8、15、22、29、36、43代,以流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,检测细胞丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果亚砷酸钠长期染毒HBE细胞至43代时,细胞生长速度明显加快,且呈浸润型生长,MMP-9分泌量升高,细胞集落数量增多。与正常对照(0代)比较,22代及以前HBE细胞内ROS、MDA及SOD的水平均呈先升高后下降的波浪形趋势;29代及以后,ROS、MDA水平逐渐下降,且以ROS表现更为明显,而SOD水平呈逐渐升高趋势。结论细胞内氧化-抗氧化平衡失调可能在低剂量砷化合物诱导HBE细胞恶性转化过程中发挥重要作用。     

烟草甲基亚硝胺吡啶基丁酮诱发HPV-18永生化人类支气管上皮细胞恶性转化

观察了烟草特异亚硝胺ＮＮＫ诱发ＨＰＶ－１８永生化人类支气管上皮细胞（ＢＥＰ２Ｄ）恶性转化过程中细胞生物学特征的变化。５００ｍｇ／ＬＮＮＫ处理ＢＥＰ２Ｄ细胞一天后,细胞在体外可连续传代,第５代细胞显示抗血清生长;第１５代细胞在半固体琼脂中的集落形成率（０．０３８％））为对照细胞（０．００３３％）的１１倍;第２５代细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为高分化鳞状细胞癌。以上结果表明ＮＮＫ致ＢＥＰ２Ｄ细胞恶性转化是一种多阶段的发展过程。该培养体系为深入研究人类支气管上皮细胞多阶段癌变的细胞和分子机制提供了一种理想的生物材料。     

反式—BPDE诱发人支气管上皮细胞系P53基因突变的研究

目的 检测苯并（a）芘的代谢产物反式－BPDE诱发的人支气管上皮细胞系P53基因突变,探讨苯并（a）芘在人肺癌发生中的作用。方法 用银染PCR－SSCP方法检测P53抑癌基因第5、6、7、8外显子的突变情况。结果 经反式－BPDE处理的人支气管上皮细胞系,20d,后P53基因第8外显子出现点突变。结论 结果提示,P53基因突变可能是苯并(a)芘诱发肺癌的早期分子事件。     

扶正解毒含药血清对硫酸镍诱导人支气管上皮细胞转化的抑制作用

目的观察中药复方扶正解毒含药血清(FJD)对硫酸镍(NiSO4)诱导培养人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化的抑制作用。方法NiSO4多次处理16HBE细胞,利用刀豆凝集素A(ConA)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性鉴定;同时添加不同剂量的FJD,观察其抗转化效应。结果NiSO4(400μmol/L)染毒8次(20代)时,细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,出现复层生长,可被ConA凝集,并可在软琼脂上生长。3种剂量FJD与NiSO4共处理组细胞转化率分别为0.82%、0.47%和0.19%,明显低于单用NiSO4组(4.13%),且呈剂量-效应关系(r=-0.884,P<0.01),细胞ConA凝集反应阴性,不能在软琼脂上生长。结论体外实验显示,FJD具有抑制NiSO4诱导16HBE细胞恶性转化的作用。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化过程中P16基因的甲基化状态

目的 分析甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)致人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时点P16基因甲基化状态的差异,探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化相关DNA甲基化机制.方法 收获GMA转化早期(染毒结束)、转化前期(第10代)、转化后期(第30代)的16HBE细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific PCR,MSP)检测该基因组P16基因启动子区的甲基化状态,并与未转化的16HBE细胞及同期培养的DMSO溶剂对照细胞进行比较.结果 转化早期及转化前期,正常对照组及DMSO溶剂对照细胞中该基因启动子区均表现为非甲基化,而GMA组细胞中表现为不同程度的甲基化,阳性对照表现为甲基化;转化后期,正常对照组细胞中该基因启动子区表现为非甲基化,而DMSO溶剂对照组及GMA组细胞中均表现为部分甲基化,阳性对照表现为甲基化.结论 在GMA诱导16HBE细胞恶性转化早期及前期P16基因的甲基化状态具有特异性,故可将其作为GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的一个早期敏感指标.     

硫酸镍诱导的人支气管上皮细胞系癌变细胞基因组不稳定性分析

目的　检测硫酸镍对基因组不稳定性的影响,从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法　采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技术对经硫酸镍在诱导人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶变细胞中的基因组不稳定性进行分析。结果　本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带,条带数在1~6条之间。7条引物中第1、4、7的3条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余4条引物均有明显差异,对于同一随机引物它们都具有特异的带型。结论　硫酸镍能诱发16HBE细胞基因组不稳定。     

硫化镍对支气管上皮细胞中磷酸化细胞外信号调节蛋白表达的影响

目的通过结晶硫化镍在支气管上皮细胞(16HBE)中磷酸化细胞外信号调节蛋白(P-ERK1)的表达,探讨镍致癌的分子机制。方法用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交(W estern b lot)法检测16HBE细胞中P-ERK1的表达。结果硫化镍不能明显激活P-ERK1的表达,染镍组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论镍不能激活P-ERK1的表达,其机制尚不清楚,硫化镍有可能激活P38和JNK通路,从而直接或间接发挥致癌作用。     

硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究

目的用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍(NiS)与二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞(16HBE)基因的差异表达;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据.方法取16HBE分为NiS处理组,BPDE处理组和16HBE(对照组)三组同步培养,传代至第35代;提取三种细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro3.0软件分析荧光信号,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS转化的16HBE细胞与BPDE转化的16HBE细胞经分析比较,呈现差异表达的基因有22个,其中11个(50%)下调,另11个(50%)上调.结论 NiS与BPDE对16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因,细胞周期蛋白相关基因,细胞凋亡和应激反应基因相关基因,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因,DNA结合、转录和转录因子类基因,细胞受体相关基因,代谢相关基因,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达.认为基因芯片技术在筛选不同种类和性质的化合物转化细胞相关基因的改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,对化合物在细胞、分子毒作用和致癌机制的研究中意义重大.     

氯化镉诱发人支气管上皮细胞恶性转化中hMSH2基因mRNA表达变化

目的探讨氯化镉诱发人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化过程中hMSH2基因mRNA动态变化的规律。方法用反转录-聚合酶链反应(PT-PCR)技术检测16HBE、氯化镉恶性转化16HBE系不同阶段(第5、15、32代细胞及成瘤细胞)hMSH2基因mRNA的表达情况。结果随着转化代数的增加,hMSH2基因mRNA的表达逐渐降低,到第32代细胞后表达明显下降(P<0.01)。结论氯化镉诱发16HBE系恶性转化过程中hMSH2基因表达逐渐下降,hMSH2基因水平的改变可能是氯化镉的致癌机制之一。     

二羟环氧苯并芘诱导16HBE细胞转化最佳实验方案

目的　采用客观又简单的软琼脂细胞集落形成率的指标来探索二羟环氧苯并芘诱导 16 HBE细胞转化的理想实验方案 ,构建恶性转化的细胞模型。方法　根据细胞存活率试验及克隆形成率试验确定诱导的剂量 ,以不同剂量二羟环氧苯并芘 1次或多次处理细胞 ,观察培养的不同阶段转化灶出现情况 ,用软琼脂培养鉴定其锚着依存性生长的恶性特征 ,比较各组转化细胞的集落形成率。结果　以 0 .1、0 .5、1.0、2 .0 μmol/ L的剂量 ,对细胞多次间断染毒 ,传代 15次 ,是二羟环氧苯并芘诱导 16 HBE细胞恶性转化的理想方案 ,其集落形成率分别为 2 .0‰、5 .5‰、7.0‰、10 .5‰ ,剂量 -反应关系呈现良好的直线相关 ,r=0 .9741,P<0 .0 5。结论　二羟环氧苯并芘能诱导人支气管上皮细胞 16 HBE转化 ,构建理想的恶性转化的细胞模型     

错配修复基因在氯化镉致16HBE细胞转化中作用

目的探讨氯化镉诱发人支气管上皮(16HBE)细胞系恶性转化过程中错配修复基因hMSH2和hMLH1的mRNA和蛋白动态变化情况。方法用反转录一聚合酶链反应(PT-PCR)和免疫组织化学(SP法)检测16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE细胞系不同阶段(第5,15,35代细胞及成瘤细胞)hMSH2基因和hMLH1基因的mRNA和蛋白的表达情况。结果随着转化代数的增加,hMSH2基因mRNA和蛋白的表达逐渐降低,至第35代细胞后表达明显下降(P<0.01);而hMLHl基因的mRNA和蛋白表达水平在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中无明显变化差异(P>0.05)。结论错配修复基因hMSH2表达水平的下调可能是镉化物分子致癌的重要机制。     

扶正解毒颗粒拮抗硫酸镍诱发大鼠睾丸某些生化指标的变化

目的探讨中药扶正解毒颗粒(FJK)对硫酸镍(NiSO4)致大鼠睾丸某些生化指标变化的拮抗作用。方法40只Wister雄性大鼠随机分为5组:生理氯化钠(NS)组;NiSO42.5mg/kg染毒组,NiSO4连续染毒30d;FJK10.0、5.0、2.5g/kg3个处理组,3组NiSO4染毒方法和剂量同染毒组,于第10天同时灌胃给予FJK处理。各组均于第31天处死大鼠,制备睾丸组织匀浆并提取线粒体。结果睾丸组织匀浆中NS组和NiSO4组谷胱甘肽过氧化物酶分别为(40.88±7.24)和(18.20±4.24)×103U/g,总抗氧化能力为(6.38±0.84)和(2.60±0.82)×103U/g,脂质过氧化物为(1.61±0.33)和(3.07±0.28)mol/g,活性氧为(5.36±2.37)和(9.71±1.62)×103U/g,2组间各项指标差异有非常显著性(P<0.01);经FJK拮抗处理后,3个FJK组上述各项指标的NiSO4毒作用均显示减轻(P<0.05或0.01)。各组大鼠睾丸细胞线粒体中总抗氧化能力、脂质过氧化物和活性氧水平的变化情况与睾丸组织匀浆相似。结论中药FJK对Ni-SO4所诱发的谷胱甘肽过氧化物酶活力、总抗氧化能力、脂质过氧化物和活性氧含量异常变化具有逆转作用。     

基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因

目的 采用基因芯片技术筛选二羟环氧苯并芘（BPDE）转化的人支气管上皮细胞（16HBE）相关基因，探讨该技术在分子毒理学研究中的应用。方法 将实验组（BPDE-16HBE）和对照组（16HBE）的mRNA逆转录合成cDNA掺入荧光分子为探针，杂交于H40S基因芯片。分析2组基因的差异表达。结果 在4096种人类基因中。BPDE转化的16HBE和正常16HBE问存在差异表达的基因有143条，其中高表达52条，低表达41条。结论 基因芯片技术在筛选BPDE转化的16HBE相关基因改变上，具有高通量、高敏感、快速等特点，在毒物的分子致癌机制研究中意义萤大．