白绒山羊PH-30基因的克隆及表达

PH-30是参与精卵质膜间相互作用中最有特征性的候选分子之一。为了检测PH-30基因在白绒山羊睾丸中特异表达情况,试验提取公山羊睾丸组织总RNA,反转录合成cDNA,并根据GenBank中公布的3种动物PH-30 cDNA序列的保守区设计1对引物,PCR扩增后纯化回收目的片段,连接pGM-T载体,挑取阳性克隆进行测序,经序列分析鉴定目的片段。结果表明,PCR扩增获得448 bp目的片段,与绵羊PH-30同源性99%,与牛PH-30的同源性为92%。多组织的RT-PCR研究结果表明,该基因只有在白绒山羊睾丸组织中特异性表达,而在其附睾头、体、尾部组织中没有表达。     

白绒山羊PH-30基因的克隆及表达

PH-30是参与精卵质膜间相互作用中最有特征性的候选分子之一.为了检测PH-30基因在白绒山羊睾丸中特异表达情况,试验提取公山羊睾丸组织总RNA,反转录合成cDNA,并根据GenBank中公布的3种动物PH-30 cDNA序列的保守区设计1对引物,PCR扩增后纯化回收目的片段,连接pGM-T载体,挑取阳性克隆进行测序,经序列分析鉴定目的片段.结果表明,PCR扩增获得448 bp目的片段,与绵羊PH-30同源性99%.与牛PH-30的同源性为92%.多组织的RT-PCR研究结果表明,该基因只有在自绒山羊睾丸组织中特异性表达,而在其附睾头、体、尾部组织中没有表达.     

乳酸脱氢酶-C4基因mRNA在绵羊睾丸和降睾中的表达研究

实验检测3乳酸脱氢酶-C4基因mRNA在绵羊睾丸和附睾中的表达情况。提取绵羊睾丸组织、附睾头、体、尾部组织总RNA，以此为模板，逆转录合成cDNA，自行设计引物，PCR扩增出347bp的目的DNA。然后，将目的片段克隆入T载体，通过菌液PCR和重组质粒酶切，鉴定重组质粒中的目的DNA。再经序列分析鉴定目的片段。同时，以β-actin为内参照物，进行RT—PCR半定量分析，比较在睾丸、附睾头、体、尾部组织中的表达量。结果表明：乳酸脱氢酶-C4在绵羊睾丸中表达量最多，尾部中表达不明显。     

乳酸脱氢酶-C4基因mRNA在绵羊睾丸和附睾中的表达研究

实验检测3乳酸脱氢酶-C4基因mRNA在绵羊睾丸和附睾中的表达情况。提取绵羊睾丸组织、附睾头、体、尾部组织总RNA,以此为模板,逆转录合成cDNA,自行设计引物,PCR扩增出347bp的目的DNA。然后,将目的片段克隆入T载体,通过菌液PCR和重组质粒酶切,鉴定重组质粒中的目的DNA。再经序列分析鉴定目的片段。同时,以β-actin为内参照物,进行RT-PCR半定量分析,比较在睾丸、附睾头、体、尾部组织中的表达量。结果表明:乳酸脱氢酶-C4在绵羊睾丸中表达量最多,尾部中表达不明显。     

精子受精抗原-1(FA-1) mRNA在绵羊睾丸和附睾中的表达

本研究通过RT-PCR检测了该基因在绵羊睾丸和附睾中的表达情况。首先,提取绵羊睾丸组织、附睾头、体、尾部组织总RNA,以此为模板,反转录合成cDNA,自行设计引物,PCR扩增出462 bp的目的DNA。然后,将目的片断克隆入T载体,通过菌液PCR和重组质粒酶切,鉴定重组质粒中的目的DNA。再经序列分析鉴定目的片断。同时,以β-actin为内参照物,进行RT-PCR半定量分析,比较精子受精抗原(FA-1)在睾丸、附睾头、体、尾组织中的表达量。结果表明,FA-1在绵羊睾丸和附睾中均表达。     

EPO在高原藏羊和平原绵羊睾丸组织中的差异性表达

为揭示促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）在高原藏羊和平原绵羊睾丸组织中的表达差异，本研究采集藏羊和绵羊的睾丸组织，采用H&E染色法观察二者睾丸组织的形态结构，采用免疫组织化学染色法对藏羊和绵羊睾丸组织中EPO表达分布差异性进行分析。H&E结果显示，藏羊和绵羊睾丸组织结构均正常，绵羊生精小管形状较藏羊更为规则，且生精上皮细胞数量较多。免疫组化结果显示，藏羊和绵羊的睾丸组织中均能检测出EPO，但EPO在藏羊睾丸组织中的表达量高于绵羊睾丸组织。由此看来，藏羊在长期适应高原低氧环境的过程中，生殖器官组织结构发生了一定适应性变化，EPO在藏羊睾丸组织中的表达程度高于绵羊睾丸组织，对藏羊睾丸低氧适应性有重要调控作用，说明EPO可能与藏羊在高原环境下维持正常繁殖性能有关。     

绵羊痘病毒山东流行株的分离鉴定与T4肽基因序列分析

从山东东营疑似绵羊痘病羊的肺脏组织中分离到1株病毒。取疑似绵羊痘病羊组织病料研磨、冻融、离心后分别接种11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜和牛睾丸继代细胞,鸡胚接种部位出现明显的痘斑;牛睾丸细胞出现聚集、变圆等明显的细胞病变。利用1对绵羊痘病毒T4肽基因特异性引物进行了PCR扩增,获得与预期大小一致的约300 bp的片段。将所得序列与GenBank收录的绵羊痘病毒、山羊痘病毒等毒株相关序列进行比较分析。结果表明,该分离株与国外其他绵羊痘病毒株具有较高的同源性,达97.4%～99.3%;与山羊痘病毒株同源性为96.4%。通过试验初步证明所分离的病毒为绵羊痘病毒,并将该毒株命名为绵羊痘病毒DY株。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与序列分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99．4％,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971．1的核苷酸同源性为90．4％。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。     

不同绵羊品种FGF5基因的多态性分析

根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5（FGFS）基因的同源序列设计引物对绵羊基因组进行PCR扩增，将扩增片段进行克隆和测序，并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较，确定扩增的片段为绵羊的FGF5基因片段。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在小尾寒羊、湖羊、藏羊、中国美利奴等4个绵羊品种的多态性。结果表明：FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性。经克隆测序分析，位于外显子1的引物1扩增产物存在G→T突变，该突变位点使编码的氨基酸发生A→S的改变；引物2扩增产物发生了碱基序列C→T的突变，这一突变位点没有引起编码氨基酸的改变，属于同义突变。对不同绵羊品种的基因型和基因频率统计结果表明，引物1扩增产物小尾寒羊、湖羊、藏羊以等位基因A为主，而中国美利奴羊则以等位基因B为主，且各群体均处于Hardy-Weinberg平衡；引物2扩增产物小尾寒羊、湖羊、中国美利奴羊均以等位基因E为主，而藏羊的基因型频率与其它品种有显著差异，中国美利奴羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态。     

绵羊痘病毒HB株的分离鉴定

从华东感染的绵羊中分离到一株病毒,命名为HB株。根据已发表的绵羊痘病毒的基因序列设计了一对引物,采用PCR方法从病毒HB株总DNA中扩增出与预期大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD-18T载体中,经Amp和蓝白斑筛选和PCR鉴定后,对阳性克隆株进行了序列测定和序列分析。扩增所得的HB株的基因片段与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.5%~100%。研究结果证实分离毒株为绵羊痘病毒。     

绵羊睾丸差异基因及蛋白质互作网络关系研究

[目的] 整合分析多个绵羊睾丸转录组数据集,揭示绵羊睾丸差异基因及蛋白质互作网络关系,以期探索影响绵羊精子生成的关键基因,为绵羊的繁殖提供理论参考。[方法] 对74个绵羊睾丸转录组进行生物信息学分析,通过limma软件包进行差异基因分析,使用WGCNA构建加权绵羊睾丸差异基因共表达网络,并通过MCODE计算网络中重要基因;利用Metascape进行功能富集分析,利用Cytoscape插件AutoAnnotate识别基因集簇。[结果] 最终筛选到11 884个基因,构建237 366对蛋白质互作关系;对2 058个差异基因构建蛋白质互作网络,产生46 169对蛋白质互作关系,确定了4个得分最高的基因集合。对2 058个差异基因构建加权共表达网络,共获得7个模块,其中Blue模块内有929个基因,功能富集分析发现显著富集于雄性配子产生、繁殖、精子发生、鞭毛运动和AMPK信号通路等,且富集结果高度连接并聚成一个完整的网络,最终确定了25个参与精子发生和精子细胞发育过程的关键基因。[结论] 本研究揭示了绵羊睾丸表达基因的蛋白质互作网络和多维差异基因的蛋白质互作网络,最终找到与睾丸精子发生相关且有互作关系的25个基因,为绵羊繁殖研究提供理论依据。     

Cry1基因在雄性绵羊生殖轴系的表达与定位

隐花色素1(Cryptochrome 1,Cry1)基因作为生物钟调控环路的负调控因子,对生物节律的稳定发挥着重要作用,因此研究Cry1基因在哺乳动物生殖轴系的表达对揭示哺乳动物季节性繁殖的调控机理有着重要意义。本实验应用qPCR和免疫组织化学等方法研究了Cry1基因在雄性绵羊生殖轴系(松果体、下丘脑、垂体、睾丸和附睾)的分布和表达情况,并通过生物信息学分析对Cry1蛋白的结构做了预测。结果显示:在绵羊生殖轴系各组织中均有Cry1表达,其中在下丘脑中的表达最高,睾丸次之,各组数据间差异显著。免疫组化结果显示Cry1蛋白在松果体和下丘脑中成弥散性表达,胞膜、胞质及胞核均有阳性表达。在垂体上Cry1蛋白主要位于毛细血管的管壁细胞和血管周围的腺细胞上。Cry1蛋白还在睾丸组织的基膜和间质细胞,以及附睾管腔上皮细胞、管周肌样细胞和腔面精子上呈阳性表达。生物信息学分析发现Cry1蛋白无信号肽信息和跨膜结构,主要位于细胞质和细胞核中,与牛、鹿的亲缘关系最近。Cry1基因参与了绵羊的繁殖,为生物钟调控哺乳动物的季节性繁殖提供了一定的研究基础。     

骨桥蛋白在长白公猪生殖细胞中的表达及其与繁殖性能的相关性

本试验旨在研究骨桥蛋白（osteopontin,OPN）在长白公猪生殖细胞中的表达和定位,并探究其与公猪繁殖性能的相关性。试验采集了长白公猪精液和不同阶段（3日龄、3月龄、6月龄和12月龄）的睾丸组织,通过蛋白印迹的方法检测OPN蛋白在精液和不同月龄睾丸中的表达,通过免疫组化的方法对OPN蛋白在公猪睾丸细胞中进行定位;同时,根据配种胎次≥ 20胎,3次配种公猪为同一头的标准,筛选并采集17头长白种公猪精液,统计相对应的1 388头母猪的生产成绩,计算得到公猪繁殖性能指标（包括窝产总仔数、窝产活仔数、分娩率和繁殖力）。低温离心精液分离得到精子和精浆,丙酮法提取精浆蛋白,Lysis buffer方法提取精子蛋白,最后运用BCA和ELISA的方法检测精子和精浆中OPN蛋白的含量,分析OPN蛋白与公猪繁殖性能的相关性。蛋白印迹结果显示,OPN在精子、精浆和各月龄阶段的长白公猪睾丸中均以两种形式表达（67.4和33.7 ku）,且67.4 ku的形式在3月龄公猪睾丸中表达量最高;免疫组化的结果显示,OPN在长白公猪的初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞中表达,在精母细胞、支持细胞和间质细胞中无表达;BCA和ELISA结果显示,精子中的OPN蛋白含量是精浆中的7倍（P<0.05）,精液中的OPN蛋白与公猪窝产活仔数显著正相关（P<0.05）。本试验结果表明,OPN在各阶段的长白公猪睾丸中都有表达,且在精子和精浆中也有表达,这可能与公猪的繁殖性能有关,从而为后期OPN蛋白在公猪受精力的研究奠定基础。     

Interaction of Potential Porcine Sperm Ligands with the Oocyte Plasma Membrane

We previously identified 62, 39, 27 and 7 kDa porcine sperm plasma membrane proteins that demonstrated a predominant affinity for the porcine oocyte plasma membrane by Western ligand blotting. The current experiments were designed to further investigate the potential roles of these molecules in sperm–oocyte plasma membrane interaction. Abilities of these proteins to bind to the oocyte plasma membrane and to inhibit sperm–oocyte interaction were evaluated. Plasma membrane was isolated primarily from the head of ejaculated porcine sperm by nitrogen cavitation and density gradient centrifugation. Fractions containing the 62, 39, 27 and 7 kDa proteins were electroeluted from one dimensional SDS polyacrylamide gels, dialysed and proteins biotinylated. Following incubation with zona‐free porcine oocytes, bound protein was visualized with 20 μg TRITC‐avidin/ml using confocal microscopy. Fractions of the dialysed, electroeluted proteins were added to porcine in vitro fertilization assays. The 62, 39, 27 and 7 kDa proteins all demonstrated binding to the oocyte plasma membrane in contrast to a biotinylated control protein. Addition of unlabelled sperm plasma membrane proteins to the biotinylated protein visibly reduced binding. Addition of each of these protein fractions to in vitro fertilization assays reduced sperm interaction with the porcine oocyte plasma membrane in a concentration‐dependent manner. Binding of these sperm plasma membrane proteins to the oocyte plasma membrane and inhibition of fertilization are consistent with these proteins being involved in sperm–oocyte plasma membrane interaction.     

洼地绵羊与四个羊种分子遗传标记的比较研究

采用RAPD技术，利用混合基因池(DNA pool)法，对洼地绵羊、小尾采羊、大尾寒羊、滩羊和鲁北白山羊进行了遗洚相关分析。其中洼地绵羊与大尾寒羊间的遗传距离为0．0560，与小尾寒羊的遗传距离为00678，与滩羊的遗传距离为0.1266，而与鲁北白山羊的遗传距离为0．3607。可以认为洼地绵羊、小尾寒羊、大尾寒羊、滩羊有共同的原始祖先，均是由蒙古羊在不同的生态条件下，经过长时期的自然选择和人工选择而形成的地方优良品种。根据遗传距离做出了它们之间的聚类图。同时在分析过程中发现，洼地绵羊、小尾寒羊、大尾寒羊和鲁北白山羊均出现了具有品种特征的特异性条带。可以作为各自的分子标记来进行品种鉴定。     

Dynamics in the membrane organization of the mammalian sperm cell and functionality in fertilization

The capacitation process of sperm cells involves complex changes in the composition and orientation of molecules at the surface of the sperm cell. Here we focus on the lipid architecture in the sperm plasma membrane and demonstrate that the sperm plasma membrane is not static but is an extremely dynamic structure. Advanced fluoroscopic techniques enabled continuous monitoring of lipid organization in living cells and extremely rapid lipid movements were observed. The orientation of lipids in the sperm plasma membrane changed under capacitative treatments, was found to be sensitive for temperature and also changed upon binding of sperm cells to the zona pellucida. The changes in membrane properties coincided with an activation of protein kinases resulting in tyrosine phosphorylation of specific plasma membrane proteins. The detected membrane changes relate to intrinsic membrane properties such as fluidity, permeability, adhesiveness and fusibility. We think that these results may provide a physiological basis for new assays, able to discriminate between functional and non-physiological sperm cells.     

Dynamics in the membrane organization of the mammalian sperm cell and functionality in fertilization

Summary

The capacitation process of sperm cells involves complex changes in the composition and orientation of molecules at the surface of the sperm cell. Here we focus on the lipid architecture in the sperm plasma membrane and demonstrate that the sperm plasma membrane is not static but is an extremely dynamic structure. Advanced fluoroscopic techniques enabled continuous monitoring of lipid organization in living cells and extremely rapid lipid movements were observed. The orientation of lipids in the sperm plasma membrane changed under capacitative treatments, was found to be sensitive for temperature and also changed upon binding of sperm cells to the zona pellucida. The changes in membrane properties coincided with an activation of protein kinases resulting in tyrosine phosphorylation of specific plasma membrane proteins. The detected membrane changes relate to intrinsic membrane properties such as fluidity, permeability, adhesiveness and fusibility. We think that these results may provide a physiological basis for new assays, able to discriminate between functional and non‐physiological sperm cells.