人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达

目的构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体。方法从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测。结果抗体库库容为5．2×106,Fab基因重组率为30％。ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体。DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。结论成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体。     

人源性天然抗体库的构建及初步鉴定

目的 构建较大容量的人源性天然抗体库。方法 以未经铭疫的健康人外周血单个核细胞为基因来源，扩增多样性的Ｋ轻链基因和 ＩｇＧ／ＩｇＭ重链Ｆｄ段基因，分别构建铡库和重链库，然后组合为Ｆａｂ段面展示的噬菌体抗体库。通过多次重组积累达到理想的库容，对抗体库进行筛选和鉴定。结果 经过５次轻、重链基因的重组和转化，获得了库容为１×1０～９的人源性天然抗体库。该抗体库性能良好，用３种抗原进行“亲和吸附－洗脱－扩增”淘筛，获得针对其中两种抗原的７株特异性噬菌体抗体。结论天然抗体库为用于不经免疫制备人源性单克隆抗体创造了良好的条件。     

人源抗戊型肝炎病毒单克隆抗体的获得与鉴定

目的　获得人源中和性抗戊型肝炎病毒 (HEV)单克隆基因工程抗体。方法　采用五轮筛选法 (逐轮降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原淘筛本室构建的HEV患者外周血源的噬菌体抗体库。获得有特异结合活性的噬菌体抗体 ,酶切鉴定抗体基因插入。切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因构建表达载体 ,在大肠杆菌中可溶性表达抗HEV抗体Fab段 ,ELISA、Westernblot检测抗体免疫学活性 ;测序分析抗体基因。结果　筛选出 4株与含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。切去gⅢ基因 ,在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段 ,表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中差异无显著性。可溶性抗体与含中和抗原表位的HEVORF2重组混合抗原有特异结合活性 ,与BSA、HBsAg无交叉结合反应。Westernblot显示在相对分子质量 (Mr)略大于 4 5× 10 3 处有一明显条带 ,与Mr4 8× 10 3 的Fab大小一致。DNA测序分析表明 ,Fab段VH 属于IgGVH3基因家族 ,VL 属于Vκ1基因家族。结论　利用噬菌体抗体库技术成功获得抗HEV的人源单克隆抗体。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建人丙型肝炎病毒 (HCV)特异性噬菌体抗体库 ,制备人源抗HCV单克隆抗体 (mAb)。方法　用常规RT PCR法 ,直接从 5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中 ,扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,与噬菌体载体pComb3连接 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 -洗脱 -扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果　RT PCR可有效地扩增出Fd和κ基因 ,并以此构建成容量为 1 2× 10 7的噬菌体抗体库。经 5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。结论　抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具     

人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定

目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.     

人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

人源性抗乳腺癌单链抗体库的筛选与初步鉴定

目的:本研究旨在已构建的大容量人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的基础上,筛选出高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并对抗体基本特性进行初步鉴定。方法:以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标,经过4轮淘洗,筛选出高亲和力的特异性抗乳腺癌scFv,并对其结构序列进行分析;通过ELISA和Western blot方法,鉴定scFv的亲和力和特异性,以及其蛋白的基本表达情况。结果:成功构建具有高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库,获得scFv的长度约为750 bp,ELISA证实所得抗体对乳腺癌细胞具有良好的亲和力和高度的特异性,IPTG诱导表达及Western blot结果显示,scFv为相对分子质量(Mr)30 000的可溶性蛋白。结论:本研究在已构建的大容量抗乳腺癌单链抗体库的基础上,筛选获得了高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库。研究结果为进一步获得可应用于临床诊断和治疗的乳腺癌靶向性抗体奠定了良好的基础。     

抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建

目的 :利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞 ,构建人源Fab段抗体文库。方法 :制备外周血淋巴细胞总RNA ,逆转录成cDNA。以其为模板 ,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因 ,并重组到噬菌粒载体pComb3中 ,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL 1Blue,酶切鉴定抗体库的重组率 ,并测定噬菌体抗体库的库容量。结果 :构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库 ,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和 75 % ,库容量为 7.2 3× 10 7。结论 :成功地构建了抗SARS CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库     

人源化Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的:构建人天然Fab段噬菌体抗体库,为人源抗体的制备建立技术平台。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,构建噬菌体抗体库,酶切鉴定有无插入片段并测序分析,用IL-2和地高辛进行富集筛选。结果:最终构建的抗体库库容约为8.4×107,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率是70%,DNA测序分析证实抗体重链属IgG亚类,轻链为λ链。用IL-2和地高辛进行三轮筛选,抗体库均得到了不同程度的富集。结论:成功构建了一个天然的人源化噬菌体抗体库,可用于下一步胰淀素人源化抗体的筛选、纯化和表达。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定

目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BAC杆状病毒表达系统来表达NH -LBP。再以NH -LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH- LBPmAb的菌株并进行鉴定。结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH- LBP, 经亲和纯化柱芯 (TALON)有效纯化后, 获得约8mg的NH- LBP。成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5. 0×108 CFU。经 8轮筛选后, 抗体库被富集 1. 85×104 倍。经ELISA法鉴定, 获得 3株可产生抗NH -LBPmAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713,AY337714 )。结论: 以昆虫细胞sf21表达NH LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的。本研究为进一步建立抗NH- LBP的二硫键稳定的Fv抗体 ( disulfidestabilizedFvfrag ments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础。     

人源化抗HCMV噬菌体ScFv库的构建

目的　构建抗巨细胞病毒噬菌体单链抗体库 ,以探索制备巨细胞病毒感染治疗用单克隆抗体。方法　巨细胞病毒感染患者外周血淋巴细胞为材料 ,建立噬菌体单链抗体库 ,并对其进行鉴定。结果　构建完成了一个滴度为 6 .5×10 6 CFU mL的抗体库。结论　源化抗巨细胞病毒噬菌体单链抗体库的建立为下一步抗体的筛选、表达奠定了基础     

人源抗体研制及应用进展

单克隆抗体(mAb)技术问世已25年,但由于人mAb制备的困难和鼠mAb的异源性,使mAb在人体内治疗方面的应用进展缓慢.近来由于人源化mAb研制的进展及突破,治疗用抗体的开发呈现了强烈的上升势头,在生物高技术领域中成为一个热点.目前mAb市场正以20%速度递增,预计2002年达11亿美元,占重组药物的9%.10年后市场上的治疗性mAb将从现在的几个增加到100个以上,预计销售额超过500亿美元.我国人源治疗性抗体的研制开发尚处于起步阶段,应当有所加强.     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制

目的 运用噬菌体表面表达技术，获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞。提取总RNA，逆转录cDNA，聚合酶链反应扩增人IgG Fab轻、重链基因，利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段，并在E.coli中进行分泌性表达。通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体，并进行序列测定。然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC-L-Fc上。转染昆虫sf-9细胞，利用杆状病毒，昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达，免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白。结果 分离到一株Fab克隆AAVs-31，腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性，间接免疫荧光试验呈阳性，序列分析结果表明是一新的序列，所获得的基因为人源IgG Fab基因。由Gamma链和Kappa链组成。表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性，免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒，不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白。结论 用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段，并在真核系统中表达了其全抗体，它们识别的可能是衣鞘蛋白组装时形成的表位。     

抗人HPPCn单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高灵敏度的抗人HPPCn单克隆抗体(mAb),以用于HPPCn的功能研究及其疾病相关性研究。方法:用重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术进行细胞融合,经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆,获得稳定分泌抗人HPPCn mAb的细胞株。采用间接ELISA、Western blot、Ig亚类快速定性试纸分析法等鉴定抗体的生物学特性;通过细胞免疫荧光实验观察了HPPCn蛋白的细胞定位。通过噬菌体肽库技术分析抗体所识别的抗原表位。结果:得到了1株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,命名为W2-D5。经Ig亚类分析确定,该细胞株分泌的抗体属于IgG1亚类。间接ELISA检测表明,该抗体检测HPPCn的极限为0.1μg/L;Western blot结果显示,该抗体能特异性识别HPPCn。细胞免疫荧光实验,证实了HPPCn蛋白定位在细胞核。通过肽库筛选及表位分析认为,该抗体识别的表位可能为HPPCn7-13(IHLELRN)。结论:成功地获得了抗人HPPCn的特异性mAb。     

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

人源化抗体研制策略分析及应用研究

鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所替代，人源化抗体开辟了抗体治疗临床应用的新时代。本文介绍并比较分析了几种制备人源化抗体的策略和抗体表达系统，并对其临床应用进行了展望。     

人源抗呼吸道合胞病毒基因工程单克隆抗体Fab段基因的筛选和表达

目的采用噬菌体表面呈现和重组抗体技术构建人噬菌体抗体基因库，筛选获得人源抗呼吸道合胞病毒（RSV）Fab段基因并在原核细胞中表达。为研制安全、有效的预防和治疗RSV感染的制剂奠定基础。方法从RSV感染患儿恢复期外周血淋巴细胞中提取细胞总RNA，用一组人IgGF出特异性引物，通过RT—PCR扩增得到一组轻链（κ和λ）和重链Fab段基因，并将此轻链和重链基因片段克隆于pComb3噬菌体载体，电转化XL1-Blu菌构建成抗RSV噬菌体抗体基因库。用纯化病毒颗粒作抗原对此抗体库进行了富集筛选，得到了特异性针对RSV的人源单克隆抗体Fab段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。用ELISA方法检测了此Fab抗体的抗原特异性，并对阳性克隆进行了基因序列分析。结果所构建的抗体库库容为108，从此抗体库中筛选得到的阳性克隆所表达的Fab抗体能与RSV纯化抗原特异性结合，保留了对RSV的抗原特异性。核苷酸序列分析证实，所获得的阳性克隆基因为人源IgG基因。结论本实验获得了特异性抗RSVFab抗体基因并在大肠杆菌中获得表达，表达产物能与RSV抗原特异性结合。