实时荧光定量PCR技术检测牙周炎致病菌中16S rRNA DNA探针的制备

利用实时荧光定量PCR和细菌16S rRNA测定技术制备牙龈卟啉菌染色体探针,并进行检测,为进一步研究牙周病可疑致病菌提供方法.主要方法是:厌氧环境下培养牙龈卟啉菌,抽提细菌DNA;根据基因库已知牙龈卟啉菌16S rRNA DNA序列,设计特异性的TaqMan探针和一对引物;经实时荧光定量PCR仪进行细菌DNA样本的PCR反应获得反应曲线.结果表明,细菌DNA样本经PCR反应后,在15个循环时,开始出现扩增曲线,此后荧光逐渐增强,在26个循环后达峰值.由此可见,利用细菌16S rRNA技术制备致病菌染色体探针,经实时荧光定量PCR测定,可以对目标微生物进行准确定性和定量.     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4．5mmol／L,400nmol／L和500nmol／L．同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为10^2个拷贝数的质粒,特异性为100％,CT（Cycle Threshold）值的变异系数CV小于5％．对送检的15份（是否感染ASFV不确定）猪肉样品进行检测,结果全为阴性．试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．     

松材线虫实时PCR检测技术

根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法.采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测.结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号.表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性.此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005 Pg的松材线虫DNA含量.实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫.     

大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确的大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定方法.方法:根据GenBank中大黄鱼、小黄鱼线粒体中ND6基因的序列,设计并合成特异性引物和cycling探针,以草鱼为阴性对照,进行实时荧光PCR反应.结果:利用设计合成的大黄鱼和小黄鱼特异性引物和cycling探针进行实时荧光PCR反应,大黄鱼和小黄鱼均产生特异扩增曲线,对照的草鱼没有产生扩增曲线.结论:利用设计的引物和cycling探针,可准确快速鉴定大黄鱼和小黄鱼.     

人GABRA1实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

根据GenBank上人GABRA1基因的序列,设计并合成特异性的引物及探针,采用TaqMan探针法建立了荧光定量PCR法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线．结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12．07-32．72,相关系数为0．999,扩增效率为96．4%.建立的GABRA1TaqMan探针实时荧光定量方法具有线性范围广、扩增效率高、检测时间短、敏感性高等特点．     

核酸外切酶Ⅲ消化双链DNA的缺失测定

测定了EXOⅢ在单位时间内所消化双链DNA的碱基对数，即缺失测定。     

基于DNA双链特征的启动子预测方法

真核启动子预测是DNA序列分析的重要问题之一.本文提出一个基于内容的新算法, 考虑DNA的双链特征,特征的出现频率用位置权矩阵表示,利用boosting算法进行训练和预测,得出的结果与其他算法相比,有很好的敏感性和特异性.     

对甲氧基苯甲醛为荧光探针测定DNA含量

基于DNA与对甲氧基苯甲醛的荧光猝灭效应,以甲氧基苯甲醛作为荧光探针建立了一种简便快速测定DNA的荧光分析方法.考察了pH、荧光探针浓度、温度、放置时间等条件对荧光探针及DNA测定的影响.该方法测定DNA含量的线性范围为51~1 000 ng/mL,检出限为30 ng/mL,10次测量500 ng/mL DNA的相对标准偏差为2.0%,可用于合成样品的测定.     

实时TaqMan PCR技术在兽医学中的应用

1绍定的浓度混合于ＰＣＲ缓冲液 ,在ＰＣＲ反应混合物体积稍有不同时 ,作为一个标准的荧光信号。背景荧光是由 96孔塑料板 ,及其检测单位的光学仪器所造成的。3　实时ＴａｑＭａｎＰＣＲ优于常规定量ＰＣＲ　　 1990年 ,首先出现了以竞争ＰＣＲ为基础的滴度法。尽管此种方法测定ＤＮＡ非常准确 ,但定量低丰度ｍＲＮＡ时 ,则应该考虑到此技术的几点不足。反转录酶 (ＲＴ)效率变化幅度可达 5 0 % ,在ＲＴ反应中 ,因加入同一已知内部对照ＲＮＡ而克服。此技术的任何模式都包括两轮ＰＣＲ :滴定和定量。利用从开始滴定法得到的结果 ,已知ＲＮＡ…     

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的 建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法 根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果 本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论 本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.     

PCR技术对肺炎支原体DNA的检测

作者首次在国内利用自己的条件完成了肺炎支原体从培养基制备、实验室培养、菌种检定、引物设计、ＤＮＡ提取．到ＰＣＲ扩增条件的摸索、产物检测等一整套技术,与非肺炎支原体、部分相关细菌进行了鉴别,并同时进行了临床样品和模拟样品的实验,结果表明该方法的特异性和灵敏性都是好的．     

粗糙集聚类分析与主成分分析法对双等位基因频率的分析与比较

运用主成分分析、聚类分析和粗糙集理论,依据Y染色体的12种单体型的双等位基因频率数据,对东北地区13种民族人群进行分类.分类方法包括3种方法各自分类、粗糙集与聚类分析结合分类的4种方法.分类结果的共同点是:日本人群、新疆的汉族、哈萨克族各自分为一类;东北地区的汉族(M Han)与新疆的汉族(X Han)不在一类;东北地区的汉族与其邻近的民族(如:蒙古族)距离较近,而新疆的汉族与维吾尔族距离相对较近.从分类结果的不同点来看,认识到3种方法的各自不足,同时获得一个重要启示:粗糙集理论与聚类分析法相结合是一种非常有意义的方法.     

细胞周期末期促进复合物亚基CDC16Hs与DNA双链断端修复蛋白Ku80相互作用

CDC16Hs是细胞周期末期促进复合物(APC)的亚基．利用基于LexA的酵母双杂交系统,把它作为诱饵蛋白筛选人胎脑文库,发现它与DNA双链断端修复蛋白Ku80的羧基端相互作用．CDC16Hs和全长Ku80的结合通过pull down实验在体外得到验证．     

大豆样品中DNA的提取与外源基因CaMV35S的PCR检测

采用试剂盒从大豆样品中成功提取出DNA,对花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了电泳检测,建立了提取大豆DNA与CaMV35S启动子PCR检测的方法,对实验操作中的问题进行了探讨.     

一种快速制备毕赤酵母表达系统P CR鉴定模板DNA的方法

文章研究了简便高效获取毕赤酵母表达系统PCR鉴定模板DNA的提取方法,采用酶消化和物理冻熔结合的方法,提取的酵母基因组DNA直接PCR扩增检测质量。结果表明,该方法提取酵母基因组DNA具有质量高、成本低、耗时短、操作简单等优点。     

两重巢式PCR检测母体外周血中胎儿游离DNA

使用两重巢式PCR技术检测母体外周血中胎儿游离DNA,为非损伤性产前鉴定胎儿性别和诊断单基因疾病奠定基础.采用改良的chelex100方法提取60例孕龄为16~36周孕妇的外周血浆中游离胎儿DNA,依据NCBIX染色体长臂ATL1位点,Y染色体上DYS14位点序列,设计并合成引物,用巢式PCR同时扩增2个基因片段,以鉴定胎儿性别.结果表明:有ATL1位点和DYS14位点的扩增产物261bp和198bp鉴定为男性胎儿,而仅有261bp扩增产物鉴定为女性胎儿.均以真实出生性别进行确认后发现,此方法能有效提高检测特异性.两重巢式PCR能够简便并准确地鉴定胎儿性别,对单基因疾病特别是X-连锁遗传病的诊断有积极意义.     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.