转基因水稻对病原菌侵染的反应和防卫基因的表达分析

 为了阐明OsBTF3基因在水稻对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染抗/感反应中的功能,本研究以OsBTF3过量表达和RNAi转基因株系为材料,比较分析了T1代株系对病菌侵染的抗感病反应,定量测定了防卫基因的表达动态。结果表明,与野生型对照株相比,无论过量表达株系,还是RNAi株系对Xoo和Xoc侵染均表现为更加感病的反应; 经Xoo接种后,过量表达和RNAi株系OE37和RNAi株系RI30防卫基因的表达发生了不同程度的变化。因此,OsBTF3增量/减量表达对水稻抗/感病性具有重要的调控作用,这种作用可能并不依赖于水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)介导的信号途径。     

基于PCR技术的植物病原菌分子定量检测技术研究进展

植物病原菌的菌源量是病害发生和流行的重要因子之一,对其精准的定量测定或检测可大大提高植物病害预测的准确性,本文对实时荧光定量PCR (qPCR)与数字PCR在植物病原菌定量检测、以及基于RNA水平的real-time PCR和基于核酸染料(EMA/PMA)与qPCR相结合的技术在植物病原菌活体定量检测中的应用进行了综述,并展望其在植物病害流行和预测中的应用前景。     

温度诱导对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达的影响

为探讨温度诱导对星豹蛛的应激反应,运用实时定量PCR法测定了不同温度对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达量的影响。结果表明:经过17、20、23、26℃诱导后,星豹蛛hsp70和hsp90基因表达量与对照组差异不显著,当高于26℃时,随着温度的升高表达量呈先升高后降低的趋势,且在38℃时最高,分别为对照组的716.46和10.44倍,差异显著;低于17℃时,表达量随着温度的降低呈逐渐升高的趋势,其中-1℃时最高,分别为对照组的334.53和9.38倍,差异显著;-1~41℃范围内,在相同诱导温度处理下,星豹蛛hsp70基因表达量显著高于hsp90基因。表明当星豹蛛受到温度高于26℃或低于17℃的刺激后,体内hsp70和hsp90基因表达量均增加,且hsp70基因表达量高于hsp90基因。说明热激蛋白只有在极端高温和低温的条件下才充分表达,从而对机体产生保护作用,且这种保护只在一定温度范围内起作用。     

水分胁迫下水稻对褐飞虱转录组的影响

为明确褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)在稻田缺水条件下的发生和灾变规律,以感虫水稻品种TN1为材料,以取食无水分胁迫水稻的褐飞虱为对照组,取食水分胁迫(以15%PEG6000营养液处理48 h模拟)水稻的褐飞虱为处理组,采用Illumina转录组测序技术研究水分胁迫下水稻对褐飞虱转录组的影响。结果显示,测序序列经拼接后得到褐飞虱全部单基因unigene共47 335条,平均长度为1 234 bp;与对照组相比,处理组中表达量差异显著的基因共有1 331条,其中表达量上调的基因有712条,表达量下调的基因有619条;随机选取20条具有显著表达差异的基因,通过实时荧光定量PCR方法检测其表达量以进行验证,其中有13条基因的表达量与测序结果变化一致。对差异表达基因进行GO注释和KEGG代谢通路功能富集分析表明,能量代谢和水分代谢相关通路在水分胁迫处理的褐飞虱中显著富集,表明这几类基因在褐飞虱应答水分胁迫中发挥了重要作用。     

利用RAPD-STS和实时定量PCR鉴别菠菜枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.spinaciae)

 菠菜枯萎病是由致病性镰刀菌(F.o.f.sp.spinaciae)引起的,是菠菜生产中的重要病害之一。利用常规方法鉴定菠菜枯萎病病原菌需耗费大量时间,并且很难得到正确的结论。随机扩增多态性DNA序列标签(Randomly amplified polymorphic DNA-sequence tagged sites,RAPD-STS)为病原菌鉴定提供了一种有效方法。本研究通过对供试菌株的RAPD分析,克隆出了1个菠菜枯萎病病原菌的特异片段(GenBank登录号:AY337463)。根据测序结果设计了1对菠菜枯萎病病原菌的特异引物,并利用常规PCR和实时定量PCR(real-time PCR)2种方法对病原菌进行了鉴定,并对2种方法的敏感性进行了比较。结果表明,2种PCR方法都可以鉴定菠菜枯萎病病原菌(F.o.f.sp.spinaciae),但二者对病原菌DNA敏感程度不同,常规PCR检测的最低DNA量100Pg,而实时定量PCR检测的最低DNA量是1pg。同时,实时定量PCR还可以对病原菌DNA进行定量分析,并依此估算病原菌的数量。该方法可用于菠菜枯萎病病原菌的快速鉴定和病因诊断。     

水稻病原菌Burkholderia plantarii群体感应和群体淬灭研究进展

植物伯克霍尔德菌Burkholderia plantarii是引起水稻秧苗细菌性立枯病的重要病原菌之一,其侵染性、繁殖力及适应性均很强,严重威胁中国水稻生产。文章围绕B.plantarii的发生、危害及致病机理,着重论述了细菌群体感应系统(quorum sensing,QS)的生理功能及其在B.plantarii致病力调控方面的最新研究进展,并进一步从根际微生物互作角度,综述了种间信号分子对病原菌群体淬灭(quorum quenching)的作用机制,同时结合种间信号分子的独特性,展望了其在新型微生物杀菌剂研发中的重要性和应用潜力。     

氯虫苯甲酰胺和氟虫腈对黏虫细胞色素P450基因表达的影响

为筛选出黏虫Mythimna separata参与杀虫剂解毒代谢的主效细胞色素P450基因,采用叶片浸渍法测定了用于处理黏虫3龄幼虫的亚致死浓度,通过构建转录组测序文库并结合数字基因表达(digital gene expression,DGE)对不同处理的黏虫进行测序,并运用实时荧光定量PCR(realtime quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术验证12个P450基因的表达情况。结果表明,用于处理黏虫的氯虫苯甲酰胺和氟虫腈亚致死浓度LC_(10)分别为0.15、13.66 mg/L;对照样品、氟虫腈处理样品和氯虫苯甲酰胺处理样品分别获得59 521 504、64 838 148和41 722 990个原始序列数据,分别获得57 441 216、62 368 912和40 285 164个过滤后的序列数据;过滤后的序列长度分别为8.62、9.36和6.04 G;碱基错误率均为0.02%;Phred数值大于20、30的碱基占总碱基的百分比均高于90.59%;鸟嘌呤+胞嘧啶(guanine cytosine,GC)含量分别为47.16%、48.94%和47.55%,表明转录组测序质量较高;黏虫受氯虫苯甲酰胺胁迫后,29个P450基因表达量上调,27个P450基因表达量下调;黏虫受氟虫腈胁迫后,23个P450基因表达量上调,26个P450基因表达量下调;12个P450基因表达量的RT-qPCR技术检测结果与DGE测序文库显示的结果基本一致。     

水稻白叶枯病菌转录调控因子基因fleQxoo和σ54因子基因rpoNxoo的分子鉴定

 为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)鞭毛生物合成及运动性的调控机理,本研究首先通过基因克隆、序列分析、缺失突变及表型测定,对转录调控因子fleQxoo和编码σ⁵⁴因子的基因rpoNxoo进行了分子鉴定。通过基因特异性扩增,成功地从Xoo菌株PXO99^A中克隆了fleQxoo和rpoNxoo。其基因序列与其它黄单胞病原菌中的同源序列高度保守。FleQxoo是NtrC家族激活蛋白成员之一,具有与σ⁵⁴作用的结构域和DNA结合保守结构域(HTH)。用标记交换法构建了△fleQxoo和△rpoNxoo基因缺失突变体。与PXO99^A相比,△fleQxoo和△rpoNxoo鞭毛产生能力丧失,运动性减弱,基因互补可以使之恢复;但其胞外纤维素酶和木聚糖酶活性以及对烟草叶片组织的致敏性无明显改变。因此,FleQxoo和σ⁵⁴主要参与了鞭毛生物合成及其运动性的调控。     

水稻条纹病毒胁迫对灰飞虱mucin基因表达量的影响

为分析灰飞虱mucin基因在水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)侵染过程中的作用,采用荧光定量PCR的方法分析了RSV 胁迫条件下灰飞虱mucin基因mRNA表达量的变化。饲喂RSV病叶1天和2天时灰飞虱mucin基因的表达量没有明显变化,而在3天和7天时灰飞虱mucin基因的表达量增加了3.60倍和1.97倍。饲喂健康水稻叶片1、2、3和7天后,灰飞虱mucin基因的表达量分别为饲喂前的1.07、1.12、0.78和0.34倍,而饲喂病叶1、2、3和7天后,mucin基因的表达量分别为饲喂前的1.15、1.19、3.19和1.01倍。结果表明,病毒胁迫使灰飞虱体内mucin基因的表达量增加,暗示mucin基因在RSV与灰飞虱互作过程中起着重要作用。     

沉默转录因子OsERF7提高水稻对褐飞虱和白背飞虱的抗性

为了解植物中特有的转录因子乙烯响应因子(ethylene responsive factor,ERF)在植物诱导抗虫反应中的作用,通过克隆1个水稻ERF转录因子基因OsERF7,并结合分子生物学、反向遗传学及生物测定,探究其在水稻防御褐飞虱Nilaparvata lugens和白背飞虱Sogatella furcifera为害过程中的作用。结果显示,机械损伤处理与褐飞虱产卵雌成虫为害均能在中后期诱导OsERF7的表达。沉默OsERF7能显著降低水稻上褐飞虱及白背飞虱卵的孵化率,并延长褐飞虱卵的发育历期;与野生型水稻相比,褐飞虱和白背飞虱在沉默突变体品系R1和R30上的卵孵化率分别只有野生型水稻上的62.5%～68.3%和68.0%～76.0%,褐飞虱卵的发育历期则延长0.37～0.45 d。沉默OsERF7不影响褐飞虱产卵雌成虫为害诱导的水稻防御相关信号分子—茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、乙烯(ET)和过氧化氢(H_2O_2)的含量。表明转录因子OsERF7作用于防御相关信号途径的下游,并且负调控水稻对褐飞虱和白背飞虱的抗性。     

Monitoring of atrazine treatment on soil bacterial,fungal and atrazine-degrading communities by quantitative competitive PCR

We report the development of quantitative competitive (QC) PCR assays for quantifying the 16S, 18S ribosomal and atzC genes in nucleic acids directly extracted from soil. QC-PCR assays were standardised, calibrated and evaluated with an experimental study aiming to evaluate the impact of atrazine application on soil microflora. Comparison of QC-PCR 16S and 18S results with those of soil microbial biomass showed that, following atrazine application, the microbial biomass was not affected and that the amount of 16S rDNA gene representing 'bacteria' increased transitorily, while the amount of 18S rDNA gene representing fungi decreased in soil. In addition, comparison of atzC QC-PCR results with those of atrazine mineralisation revealed that, in response to atrazine treatment, the amount of atzC gene increased transitorily in soil pre-treated with atrazine, suggesting that accelerated atrazine biodegradation in soil could be due to a transient increase in the size of the atrazine mineralising community.     

番茄煤污假尾孢叶斑病菌实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

为快速、准确地对番茄煤污假尾孢Pseudocercospora fuligena进行检测与定量分析,基于其Avr4基因设计特异性引物JWB-9F/JWB-7R,建立实时荧光定量PCR检测技术,分析该检测技术的特异性和灵敏度,并利用采集自重庆市、河北省和广西壮族自治区的14份材料对该检测技术的应用效果进行验证。结果表明,引物JWB-9F/JWB-7R仅可从番茄煤污假尾孢基因组DNA中扩增出232 bp的目的片段,特异性良好;实时荧光定量PCR检测技术的灵敏度为67.09 copies/μL,是普通PCR检测技术的1 000倍。且该实时荧光定量PCR检测技术可以实现未显症样本中番茄煤污假尾孢的定量检测,检测限为6.02×10~2copies/μL,实际应用效果较好。表明所建立的实时荧光定量PCR检测技术可用于番茄煤污假尾孢叶斑病的早期诊断和预测预报。     

Bioluminescence reporter assay system to monitor Arabidopsis MPK3 gene expression in response to infection by Botrytis cinerea

The Arabidopsis MPK3 gene product participates in disease resistance mediated by the MAP kinase cascade. The expression of the MPK3 gene is induced by pathogen inoculation and treatment with chemicals such as salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (JA), but the detailed expression pattern of the MPK3 gene has been largely unknown. To investigate MPK3 gene expression in response to disease stress, we fused the MPK3 promoter to the firefly luciferase gene to create a real-time monitoring system for regulated gene expression in planta. The results of an in vivo reporter assay using transgenic Arabidopsis plants harboring MPK3::Fluc showed that the MPK3 promoter activity was induced by treatment with chemicals such as SA and benzo(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH), that induce defense gene expression. Inoculation with the fungal pathogen Botrytis cinerea resulted in systemic induction of MPK3::Fluc.     

8个WRKY转录因子在水稻叶片生长和抗病过程中的表达分析

 WRKY是植物体内最大的转录因子家族之一, 其成员在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用。为了解水稻WRKY的功能, 本研究利用蛋白质免疫印迹(western blotting, WB)技术, 检测了8个WRKY转录因子在水稻叶片生长和Xa21介导的抗白叶枯病过程中的表达丰度变化。结果表明:OsWRKY12、43、55和86在苗期表达量较低, 随叶片的生长表达逐步增加;OsWRKY50和84在苗期叶片中的表达量相对较高, 成熟期下降;未检测到OsWRKY40/64和52在叶片中的表达。在Xa21介导的白叶枯病抗性反应中, OsWRKY40/64、50和52受白叶枯病菌诱导表达, OsWRKY84受侵染后表达量上调, OsWRKY12、43、55和86在抗病过程中没有检测到表达丰度的变化。进一步比较这些转录因子在抗、感和对照(Mock)反应中的表达, 发现抗、感反应间蛋白质的表达变化是相似的。研究结果提示:OsWRKY12、43、55和86可能在叶片正常生长中发挥作用;OsWRKY40/64和52可能在水稻-白叶枯病菌互作过程中发挥作用;OsWRKY50和84则在叶片生长和抗白叶枯病过程中都有一定的功能。