慢病毒介导的过表达miR181a基因修饰的骨髓间充质干细胞系的建立

目的:构建携带过表达miR181a的慢病毒载体,转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC),使基因修饰后的BMSC持续高水平表达miR181a。方法:将miR181a质粒与三种助转质粒PRSV,PRRE,VSVG共同转染进293T细胞中,构建含有增强型绿色荧光蛋白(enha...     

慢病毒介导的CCN1基因对大鼠骨髓间充质干细胞

 目的：探讨外源性CCN1对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长和迁移的作用。方法：构建带有绿色荧光蛋白的大鼠CCN1慢病毒载体（Lenti-GFP-CCN1）并感染大鼠BMSCs,筛选最适感染复数（MOI）;实验分为空白组、感染Lenti-GFP组和感染Lenti-GFP-CCN1组,倒置荧光显微镜下观察BMSCs感染后荧光表达情况;MTT法检测细胞存活率,划痕愈合实验检测细胞迁移作用。结果：与空白组和阴性对照组相比,Lenti-GFP-CCN1感染大鼠BMSCs后,细胞的存活率未见明显差异;感染组细胞划痕愈合实验的愈合宽度/原宽度值与空白组及阴性对照组相比差异显著（P<0.05）。结论：外源性CCN1对正常大鼠BMSCs存活率无影响,可促进BMSCs迁移。     

NK4基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

本研究构建携带人NK4基因的慢病毒载体,并将其转染人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),明确转染后NK4表达情况。通过聚合酶链反应从HGFcDNA文库中克隆NK4基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pGC-FU-NK4,实时定量PCR检测病毒滴度。所获慢病毒(Lenti-NK4)转染hBMSCs后,荧光显微镜下观察荧光表达。ELISA检测培养上清中NK4表达。结果显示,所获NK4基因测序后与GeneBank报到序列完全一致,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×108TU/ml。Lenti-NK4转染hBMSCs后胞膜及胞浆有荧光分布,培养上清中NK4含量随感染时间延长而增加。提示携带NK4的慢病毒能安全、有效地转染hBMSCs,持续稳定表达。     

慢病毒转染骨髓间充质干细胞在脊柱融合中的作用

目的 评价慢病毒转染的骨髓间充质干细胞诱导大鼠脊柱融合的能力.方法 构建携带骨形态发生蛋白2(BMP-2)的慢病毒并将其转染到骨髓间充质干细胞中,观察细胞的碱性磷酸酶染色和活性.并将转染的细胞移植到大鼠脊柱融合模型中,8周后处死大鼠,对其脊柱标本进行手触力学测试,Micro-CT扫描和组织学切片观察.结果 慢病毒转染细胞的碱性磷酸酶染色明显好于未转染细胞(3.2±0.4比1.1± 0.2,P＜0.05).转染的细胞移植到大鼠体内8周后,X线、Micro-CT、手触力学测试和组织学切片均显示转染的大鼠脊柱标本全部达到骨性融合.而未转染的大鼠脊柱标本均未融合.结论 慢病毒转染的骨髓间充质干细胞能够诱导脊柱融合,可作为基因载体工具用于脊柱融合.     

慢病毒介导GDNF基因对食蟹猴骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

 目的 探讨慢病毒介导胶质源性神经营养因子（GDNF）对食蟹猴骨髓间充质干细胞（cMSCs）生物学特性的影响。方法 无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离培养cMSCs,含有GDNF基因的慢病毒感染cMSCs。利用ELISA、Real-time PCR、流式细胞术（FCM）、BrdU掺入法等实验方法,观察慢病毒感染后GDNF基因的表达,以及慢病毒感染前后的cMSCs的表面抗原表达、体外增殖和分化能力。结果 感染慢病毒后,体外培养的cMSCs高表达GDNF。慢病毒感染后cMSCs的细胞形态无明显改变,细胞表面标志CD34、CD90和Stro-1阳性细胞比例增高。BrdU掺入结果显示,与对照组（0.61±0.11）比较,GDNF慢病毒感染组（0.50±0.13）明显降低（P＜0.05）。但GDNF慢病毒感染并没有影响cMSCs体外脂肪诱导分化能力。结论 慢病毒感染影响cMSCs的表面抗原表达和体外增殖能力,但对cMSCs体外脂肪分化能力无影响。     

慢病毒介导的Isll基因在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的研究慢病毒介导的Isll基因在人骨髓间充质干细胞（hMsc）中的表达情况,并检测其下游基因Nkx2．5和Flk一1的表达。方法多位点Gateway载体构建技术构建2K7puro／EF1α-Isll慢病毒表达载体（由EF1α启动子启动Isll基因表达）。包装细胞293FT细胞获得慢病毒,再转染至hMSC。利用嘌呤霉素抗性筛选出Isll阳性细胞。应用RT．PCR、Westernblotting检测hMSC中Isll基因在转染后1-6周的mRNA和1—4周的蛋白表达情况。结果成功构建了慢病毒载体EF1α—Isll,转染后hMSC中检测出Isll基因mRNA和蛋白的表达,其mRNA表达随着培养时间延长而上调,第3周表达量（0．65±0．14）较1、2周增多（0．36±0．09,0．37±0．05,均P〈0．05）,3周后表达趋于稳定。转染后在无任何诱导剂的情况下,检测到Isll下游基因Nkx2．5的表达,但尚未见Flk-1的表达。结论通过慢病毒载体将Isll基因转染hMSC后,可获得长期稳定的表达,并在无任何诱导剂的情况下,能促进下游基因Nkx2．5的表达。     

慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体联合神经生长因子过表达促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖

文题释义：P75神经营养因子受体(P75 Neurotrophin receptor,P75^NTR)：属于一种Ⅰ型糖蛋白,在非神经系统组织及多种肿瘤细胞中表达。p75^NTR与Trk受体通过不同的信号传递对细胞增殖与凋亡发挥着双重的生物效应。神经生长因子：在神经生长因子信号通路中,p75^NTR可以与神经生长因子相结合,引起神经酰胺的释放而激活JNK通路来调节细胞的增殖和凋亡。  摘要背景：P75神经营养因子受体(P75 Neurotrophin receptor,P75^NTR)是神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的受体之一。在各种细胞组织中发挥着促进增殖或凋亡的双重作用,且P75^NTR在骨折不愈合处存在高表达,而过量的NGF可关闭P75^NTR受体,从而挽救受损的细胞。因此研究沉默P75^NTR联合NGF过表达共转染对骨髓间充质干细胞增殖的影响,可为临床治疗骨折不愈合提供新思路。目的：观察慢病毒介导沉默P75^NTR联合NGF过表达共转染对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响。方法：体外培养至第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞分为空白对照组、阴性对照组、沉默p75^NTR组、NGF过表达组、沉默p75^NTR联合NGF过表达组。将慢病毒介导沉默P75^NTR、过表达NGF转染至大鼠骨髓间充质干细胞,倒置荧光学显微镜观察慢病毒转染第3天细胞形态变化,流式细胞仪检测转染效率及Western blot方法检测P75^NTR和NGF的表达,最后用MTT法和CCK-8法检测各组细胞增殖活性。结果与结论：①共转染慢病毒后的细胞生长、分布良好;双基因慢病毒载体的转染效率已超过70%;②与空白对照组和阴性对照组比较,沉默P75^NTR联合NGF过表达组P75^NTR蛋白表达明显下调,NGF蛋白表达明显增加;③与空白对照组与阴性对照组相比,沉默P75^NTR联合NGF过表达组、沉默P75^NTR组、NGF过表达组细胞增殖明显加快,差异有显著性意义(P < 0.05),其中沉默P75^NTR联合NGF过表达组增殖最快;④结果显示：沉默P75^NTR联合NGF过表达共转染可促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖。ORCID: 0000-0003-3826-7213(王宁) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

SOCS1在人骨髓间充质干细胞中的表达以及稳定表达SOCS1间充质干细胞株的建立

目的 探讨不同炎性因子刺激下细胞因子信号转导抑制分子-1(suppressor of cytokine signaling1,SOCS1)在人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达情况,并研究稳定表达SOCS1的MSCs细胞株的建立方法.方法 用SOCS1相关炎性因子刺激剂处理24小时后裂解MSCs,Westen Blot检测各组细胞SOCS1的表达.通过Gateway技术,构建出表达SOCS1基因的载体质粒pFinal/PGK-puro-EF1 α-SOCS1-IRES-EGFP,将其与包装质粒共转染293FT细胞产生慢病毒,通过多次感染将载体导入人骨髓间充质干细胞,流式细胞术筛选出稳定表达SOCS1的人骨髓间充质干细胞,并用Westen Blotting、流式细胞术、成骨成脂肪诱导分化来鉴定.结果 SOCS1蛋白在IFN-γ、Pam3CSK4、Poly(I∶C)、LPS和ODN 2006刺激的MSCs中表达升高(P＜0.01).表达载体包装出的病毒感染后的MSCs中SOCS1蛋白水平提高,流式细胞检测表达(＞95％)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166,不表达(＜2％)CD34和CD45,在相应诱导剂诱导下可分化为成骨细胞和脂肪细胞.结论 多种炎性因子能诱导MSCs内SOCS1表达升高,说明SOCS1可能参与了MSCs的免疫调节功能;成功建立了稳定表达SOCS1的MSCs细胞株.     

慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞中的表达

研究慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达情况,并检测其下游基因Nkx2.5和Flk-1的表达。方法 多位点Gateway载体构建技术构建2K7puro/EF 1α-Isl1慢病毒表达载体(由EF1α启动子启动Isl1基因表达)。包装细胞293FT细胞获得慢病毒,再转染至hMSC。利用嘌呤霉素抗性筛选出Isll阳性细胞。应用RT-PCR、Western blotting检测hMSC中Isl1基因在转染后1～6周的mRNA和1～4周的蛋白表达情况。结果　成功构建了慢病毒载体EF1α-Isl1,转染后hMSC中检测出Isl1基因mRNA和蛋白的表达,其mRNA表达随着培养时间延长而上调,第3周表达量(0.65±0.14)较1、2周增多(0.36±0.09,0.37±0.05,均P＜0.05),3周后表达趋于稳定。转染后在无任何诱导剂的情况下,检测到Isl1下游基因Nkx2.5的表达,但尚未见Flk-1的表达。结论通过慢病毒载体将Isl1基因转染hMSC后,可获得长期稳定的表达,并在无任何诱导剂的情况下,能促进下游基因Nkx2.5的表达。     

慢病毒载体Pax6-EGFP构建及转染人骨髓间充质干细胞

BACKGROUND:Pax6 gene plays an important role in eye development and differentiation, and to study how it regulates the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), gaining the BMSCs stably over-expressing Pax6 is crucial, which is also the basis of stem cell replacement therapy. OBJECTIVE:To construct a lentivirus vector containing Pax6 and detect the expression of Pax6 in transfected human BMSCs. METHODS:Pax6 gene was extracted using PCR. After its connection with lentivirus vector pHIV-EGFP, it was then packaged by 293T cells. The human BMSCs were transfected with recombinant lentivirus Pax6-EGFP as well as lentivirus vector pHIV-EGFP, which was considered negative control group. The cellular morphology was observed by a fluorescence microscope, and the mRNA expression of Pax6 was detected by real-time PCR. RESULTS AND CONCLUSION:The recombinant lentivirus Pax6-EGFP was constructed successfully with a titer of 3×109 pfu/L. After the transfection, both the green fluorescent protein and Pax6 gene were expressed detected using fluorescence microscope and real-time PCR, showing that the method of lentiviral transfection is a safe and effective way to modify BMSCs.     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。 目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。 方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope 共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72 h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。 结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×10⁸ TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P < 0.05),MOI值为10的组能获得>70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

HCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞重建起搏离子通道If

目的 研究慢病毒载体介导超极化激活的环核苷酸门控通道基因4 (HCN4)转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)重建起搏离子通道的可行性。方法 全骨髓法分离大鼠股骨及胫骨的MSCs,流式细胞术鉴定rMSCs;四质粒表达系统构建包含目的基因HCN4的慢病毒载体lentiV-HCN4-GFP,对照组慢病毒载体为仅含有报告基因GFP 的慢病毒载体lentiV-GFP;慢病毒载体转染rMSCs;RT-PCR及荧光显微镜检测HCN4在rMSCs中的mRNA及蛋白表达;电压钳检测阳性转染细胞的起搏电流的特点。结果 HCN4基因转染MSCs的阳性率约60%;实验组RT-PCR产物出现480bp的目的条带;阳性转染细胞中可记录到明显的时间和电压依赖性的超极化激活内向电流(Ifunny, If),激活的阈电压为-80mV,该电流对低浓度CS＋敏感;对照组未检测到相应的mRNA表达和超极化激活的电流。结论 慢病毒载体能够介导HCN4基因高效转染MSCs,表达为起搏离子流通道。     

新型慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞基因转导中的应用

背景：构建一个组成性表达某特定基因同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒载体目前未见报道。 目的：观察新型慢病毒载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP在人骨髓间充质干细胞基因转导中的表达。 方法：通过PCR在PEDF基因的两端加上attB位点,构建表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP,将表达载体与包装质粒(ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix)共转染293FT细胞。通过多次感染的方法将慢病毒载体导入人骨髓间充质干细胞,转导后第7天开始使用1~5 mg/L嘌呤霉素筛选5 d,得到表达PEDF和EGFP的人骨髓间充质干细胞,并进行Western、Elisa的鉴定分析。 结果与结论：经PCR和测序证实,慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP构建成功;将其成功导入人骨髓间充质干细胞,经过筛选获得纯化的过表达PEDF基因的绿色荧光细胞群。     

miR-34b对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及相关机制

目的：探讨miRNA-34b在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达及其可能的作用靶点和作用机制。方法：采用密度梯度离心和全骨髓贴壁相结合的方法分离培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs),并在体外诱导成骨分化。采用实时荧光定量PCR技术,检测hBMSCs成骨分化过程中的miR-34b的表达水平;然后过表达miR-34b,进一步观察其对hBMSCs成骨分化的影响。同时检测过表达miR-34b对成骨分化的关键信号通路之一Notch信号通路的活性影响,初步探讨其可能涉及的作用机制。结果：成功分离出hBMSCs,并构建了hBMSCs体外诱导成骨分化模型;且随着成骨诱导培养时间的延长,miRNA-34b表达水平逐渐降低。ALP活性检测、茜素红染色检测结果显示过表达miRNA-34b后,ALP活性显著降低,且茜素红染色的钙盐结节明显减少;同时Western blot实验结果显示过表达miRNA-34b后,成骨特异性标记分子Runx2的蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。此外,过表达miRNA-34b后,Notch信号通路的活性显著降低。结论：miRNA-34b能够负向调控人骨髓间充质干细胞成骨分化;其作用机制可能与抑制Notch信号通路的活性有关,提示miRNA-34b可以作为诊断和靶向治疗慢性炎症性骨疾病的潜在作用靶点。     

miR-193通过细胞周期相关蛋白调控大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力*

 目的： 探讨microRNA-193（miR-193）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs）增殖和凋亡的影响,并进一步分析miR-193影响MSCs增殖的可能机制。方法: 体外培养大鼠MSCs,分别转染miR-193片段或其抑制剂到MSCs。采用MTS法、BrdU细胞增殖比色法和Ki-67免疫染色法检测细胞增殖,AnnexinV/PI双染流式细胞术分析细胞凋亡,qRT-PCR检测miR-193对细胞周期相关蛋白表达的调控。结果: (1) siPORT NeoFX Transfection Agent转染miR-193到MSCs 能有效调控MSCs中miR-193的表达水平。(2) 过表达miR-193能显著促进MSCs 的增殖（P<0.05）,而抑制miR-193能显著降低MSCs 的增殖（P<0.05）。(3) miR-193对MSCs的凋亡无明显影响（P>0.05）。(4)qRT-PCR结果显示miR-193能调控细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）的表达水平（P<0.01）。结论: miR-193具有促进MSCs增殖的作用,并且可能是通过增强CDK2的表达来实现的。     

慢病毒介导核受体相关因子1基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠

目的探讨慢病毒介导核受体相关因子1(Nurrl)基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植至帕金森病(PD)模型大鼠纹状体后对PD大鼠的治疗作用。方法采用神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)纹状体注射成功制备PD大鼠模型18只,将携带绿色荧光的慢病毒GV287-Nurr1感染大鼠BMSCs,然后随机移植入6只PD模型大鼠的纹状体内(实验组),设生理盐水组(假移植组)6只及感染空慢病毒GV287的BMSCs组(对照组)6只;术后第1、2、4周观察大鼠的行为改善情况;免疫组织化学染色法检测纹状体及黑质中Nurrl和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达变化;RT-PCR法检测黑质Nurrl mRNA和TH mRNA的表达变化。结果慢病毒感染后的BMSCs及上清中均检测到Nurr1蛋白;对照组与实验组大鼠在移植后第1、2、4周的旋转行为较假移植组均有所改善,且实验组比对照组改善更明显;实验组纹状体Nurr1阳性细胞有效存活并沿胼胝体向皮质及对侧脑组织迁移;实验组纹状体及黑质损毁侧Nurrl和TH蛋白及mRNA的表达较假移植组和对照组明显增高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论慢病毒介导Nurr1基因修饰大鼠BMSCs移植治疗PD大鼠,能有效地改善PD模型大鼠的行为学症状,增加大鼠脑内纹状体和黑质区Nurr1和TH的表达。     

骨髓间充质干细胞研究进展

骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一.虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决.主要对间充质干细胞的异质性、分化与融合的问题、修复组织的机制、免疫性及研究方法等问题进行了综述.     

雌激素在骨髓间充质干细胞中的表达和作用

本文说明了雌激素在骨代谢中的作用,骨髓间充质干细胞(MSCs)分化功能以及雌激素在骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨和成脂肪诱导分化过程中的作用及机制,有利于了解骨质疏松症的发病机制,为骨质疏松症的预防和治疗提供了理论基础。     

慢病毒介导survivin体外转染MSCs及功能测定

目的:探讨存活素(Survivin,Svv)基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)在离体微环境中延长生存能力的机制,为新的干细胞抗凋亡移植策略提供理论依据.方法:制备Svv重组慢病毒和空白对照病毒,测定病毒滴度及转染率大于90％时的MOI值;分别进行转染后成骨诱导分化测定;RT-PCR比较转染前后survivin表达变化情况.结果:成功包装出Svv慢病毒和空白病毒,实验组病毒滴度为7.1×10 7TU/mL,空白病毒组为8.3×107 TU/mL;转染率大于90％时的MOI值Svv慢病毒和空白病毒分别为28.4和8.3;转染后的Svv慢病毒和空白病毒均能向成骨分化;同时RT-PCR结果显示转染后明显过表达survivin.结论:慢病毒成功转染MSCs且具有其分化功能,同时过表达survivin,为体内研究靶细胞的存活时间提供了实验基础.