血管内皮细胞生长因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的构建特异性的人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因siRNA真核细胞表达载体，为探索RNA干扰（RNM）分子靶向治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的作用奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的VEGF基因核苷酸序列，按照Keynolds设计原则，针对VEGF的序列及二级结构选择靶序列，设计双链小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（Small hairpin RNAs，shRNA）的DNA序列，并与pRNAi-H1质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子Hl的真核表达载体pRNAi-H1VEGF siRNA，经限制性内切酶酶切、PCK和DNA测序进行鉴定。结果构建针对人VEGF的RNM真核细胞表达载体经限制性内切酶酶切、PCK和DNA测序证实与设计完全一致。结论针对人VEGF的RNM真核细胞表达载体构建成功。     

人组织因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的:利用RNA干扰(RNAi技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体.方法:根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序.结果:构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致.结论:成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法.     

构建RNA干扰真核表达载体抑制肝癌细胞IGF1R表达的研究

目的 构建胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)RNA干扰真核表达载体,探讨人肝癌细胞株MHCC-97H在IGF1R基因抑制前后黏附和侵袭能力的变化及相关信号分子的变化.方法 以pGCsi-U6-Neo-GFP为空白质粒载体,以IGF1R为靶基因,按GeneBank IGF1R基因核苷酸序列和Tusch1设计原则,选择5对2条互补的带发夹结构的核苷酸序列,连接到pGCsi-U6-Neo-GFP空载体中.转化大肠杆菌Stable3,扩增后提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析.转染模型细胞(293T),进行RT-PCR及Western blotting检测,筛选出沉默效果最好的质粒载体.用脂质体转染MHCC-97H肝癌细胞,G418筛选并建立IGF1R基因沉默的MHCC-97H肝癌细胞株.检测MHCC-97H细胞株黏附和侵袭能力及FAK蛋白的表达变化.结果 构建的IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA,经酶切和DNA测序证实与设计完全一致;RT-PCR及Western blotting检测发现IGF1R沉默效率达88%.MHCC-97H细胞IGF1R被沉默后黏附和侵袭能力下降,FAK蛋白表达下降.结论 IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA能够降低MHCC-97H细胞黏附和侵袭能力并抑制FAK蛋白的表达.     

RNA干扰Neuropilins-2基因真核表达载体的构建及其鉴定

目的 构建Neuropilins-2(NRP2)基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以NRP2为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构件重组体,根据GenBank数据库提供的NRP2基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.重组pGenSil-NRP2载体转染LOVO细胞48 h,收获细胞,采用Western blotting检测其NRP2蛋白表达.结果 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功.重组体pGenSil-NRP2转染LOVO细胞48 h后NRP2蛋白表达显著降低.结论 利用RNAi技术可成功构建抑制NRP2表达的小干扰RNA重组体.     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒.方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM 3.1-H1 neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体.采用酶切法和测序法鉴定.结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66 bp模板寡核苷酸片段和4.3 kbp的线性化的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体片段.重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符.结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础.     

靶向分化相关基因NDRG1的siRNA表达载体的构建

水平降低.结论:成功构建了针对NDRG1基因的siRNA表达载体.     

构建RNA干扰真核表达载体抑制肝癌细胞IGF1R表达的研究

目的 构建胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)RNA干扰真核表达载体,探讨人肝癌细胞株MHCC-97H在IGF1R基因抑制前后黏附和侵袭能力的变化及相关信号分子的变化。方法 以pGCsi-U6-Neo-GFP为空白质粒载体,以IGF1R为靶基因,按GeneBank IGF1R基因核苷酸序列和Tusch1设计原则,选择5对2条互补的带发夹结构的核苷酸序列,连接到pGCsi-U6-Neo-GFP空载体中。转化大肠杆菌Stable3,扩增后提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。转染模型细胞（293T）,进行RT-PCR及Western blotting检测,筛选出沉默效果最好的质粒载体。用脂质体转染MHCC-97H肝癌细胞,G418筛选并建立IGF1R基因沉默的MHCC-97H肝癌细胞株。检测MHCC-97H细胞株黏附和侵袭能力及FAK蛋白的表达变化。结果 构建的IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA,经酶切和DNA测序证实与设计完全一致;RT-PCR及Western blotting检测发现IGF1R沉默效率达88%。MHCC-97H细胞IGF1R被沉默后黏附和侵袭能力下降,FAK蛋白表达下降。结论 IGF1R pGCsi-U6-Neo-GFP shRNA能够降低MHCC-97H细胞黏附和侵袭能力并抑制FAK蛋白的表达。     

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。     

NDRG1基因在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨分化相关基因NDRG1蛋白在子宫内膜癌中的表达及临床意义.方法 采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶链接法检测子宫内膜癌组、不典型增生子宫内膜组及正常子宫内膜组中NDRG1蛋白的表达.结果 子宫内膜癌组中NDRG1表达水平明显高于不典型增生子宫内膜组及正常子宫内膜组,表达水平与肌层浸润、淋巴结转移有关,深肌层浸润的表达高于浅肌层浸润,有淋巴结转移的表达高于无淋巴结转移,NDRG1蛋白表达与癌组织的分级、FIGO临床分期无关.结论 NDRG1蛋白的高表达与子宫内膜癌的发生发展有关;检测NDRG1蛋白对于子宫内膜癌的早期诊断有重要参考价值.     

补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的观察不同浓度补阳还五汤(BYHWD)含药血清对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)增殖和迁移影响。方法补阳还五汤灌胃SD大鼠后腹主动脉取血,制备含药血清;体外培养人脑微血管内皮细胞(HBMECs),随机分为空白组(正常大鼠血清)及补阳还五汤含药血清组,血清浓度分为5%、10%和20%3个浓度,共6组;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HBMECs增殖;细胞划痕法检测HBMECs迁移的相对距离。结果与空白组比较,5%、10%和20%含药血清均显著促进HBMECs增殖,差异有统计学意义(0.71±0.03比0.65±0.03、0.84±0.05比0.75±0.03、0.71±0.05比0.67±0.05,P0.05);与10%含药血清组比较,5%含药血清组和20%含药血清组细胞增殖显著减少,差异有统计学意义(0.71±0.03、0.71±0.05比0.84±0.05,P0.05)。与空白组比较,各含药血清组细胞迁移的相对距离均显著增加,差异有统计学意义(0.58±0.03比0.50±0.01、0.63±0.03比0.45±0.05、0.53±0.05比0.45±0.04,P0.05);与10%含药血清组比较,5%含药血清组和20%含药血清组细胞迁移的相对距离显著减小,差异有统计学意义(0.58±0.03、0.53±0.05比0.63±0.03,P0.05)。结论补阳还五汤含药血清可促进HBMECs增殖和迁移,10%含药血清作用最佳。     

食管鳞癌组织中NDRGl mRNA和蛋白的表达

目的：探讨食管鳞癌组织中NDRGlmRNA和蛋白的表达情况及其与临床病理因素的关系。方法：分别采用RT-PCR和免疫组织化学SP法检测49例食管鳞癌组织（分化程度Ⅰ级14例，Ⅱ级23例，Ⅲ级12例；有淋巴结转移2l例，无淋巴结转移28例）、23例癌旁不典型增生黏膜组织及49例正常食管黏膜组织中NDRG1 mRNA和蛋白的表达。结果：食管鳞癌组织中NDRG1 mRNA相对含量低于癌旁不典型增生黏膜组织及正常食管黏膜组织（P〈0．05或0．01）；不同分化程度的食管鳞癌组织之间NDRG1 mRNA相对含量差异无统计学意义（P〉0．05）；伴淋巴结转移的食管鳞癌组织与无淋巴结转移的食管鳞癌组织NDRG1 mRNA相对含量差异无统计学意义（P〉0．05）。癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中NDRG1蛋白（＋＋）阳性率（3／23和4／49）均低于正常黏膜组织的43／49（P〈0．01）；食管鳞癌组织中NDRG1蛋白表达与癌组织的分级及有、无淋巴结转移无关（P均〉0．05）。结论：食管鳞癌组织中NDRG1 mRNA和蛋白表达降低，其低表达可能与食管鳞癌发生有关。     

人组织因子基因RNA干扰载体的构建与鉴定

目的 构建人组织因子基因RNA干扰载体,为达到阻止凝血过程的启动打下基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计人组织因子基因(NM 001993)干扰片段,合成shRNA序列,再制备双链寡核苷酸(ds oligo),退火后形成的ds oligo双链克隆到pENTRTM/U6载体的粘性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒DNA小提、测序.将构建的载体转染到脐静脉内皮细胞,应用RT-PCR和免疫荧光验证载体对目的基因的干扰情况.结果 测序证实阳性克隆为pENTRTM/U6-TF-shRNA,转染到脐静脉内皮细胞后组织因子的表达受到明显抑制.结论 成功构建出凝血途径的人组织因子基因RNA干扰载体,为研究组织因子基因RNA干扰载体在凝血疾病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.     

人支架蛋白IQGAP1-shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 制备携带人支架蛋白IQGAP1基因小分子干扰RNA的重组慢病毒.方法 分别设计合成针对IQGAP1的4个shRNA慢病毒干扰载体;分别转染293T细胞,利用Western blot验证shRNA的沉默效果,选择其中一个沉默效果较好的shRNA慢病毒干扰载体同源重组产生Lentivirus- IQGAP1-shRNA并测定病毒滴度.结果 测序证实,构建携带IQGAP1-shRNA的慢病毒载体具有较好的沉默靶基因的效果,包装慢病毒,病毒滴度为2.0×l010TU/ml.结论 成功制备携带IQGAP1-shRNA的重组慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒.     

1,25-(OH)2VitD3对食管癌细胞分化相关基因NDRG1表达的影响

目的了解1，25-（OH）2VitD3对食管癌细胞分化相关基因NDRG1表达的影响。方法采用1,25-（OH）2VitD3作用于人食管癌EC9706细胞，应用免疫组化和RT—PCR方法分别检测1,25-（OH）2VitD3作用不同时间后NDRG1基因的表达。结果1，25-（OH）2-VitD3作用24h～5d NDRG1基因蛋白和mRNA均显著高于对照组水平（P〈0．05）。结论1,25-（OH）2 VitD3可上调EC9706细胞分化相关基因NDRG1表达，促使其分化。     

Polylactic Acid Nanoparticles Targeted to Brain Microvascular Endothelial Cells

In this work, blank polylactic acid （PLA） nanoparticles with unstained surface were prepared by the nano-deposition method. On the basis of the preparation, the effect of surface modification on brain microvascular endothelial cells （BMECs） targeting was examined by in vivo experiments and fluorescence microscopy. The results showed that PLA nanoparticles are less toxic than PACA nanoparticles but their BMECs targeting is similar to PACA nanoparticles. The experiments suggest that drugs can he loaded onto the particles and become more stable through adsorption on the surface of PLA nanoparticles with high surface activity. The surface of PLA nanoparticles was obviously modified and the hydrophilicity was increased as well in the presence of non-ionic surfactants on PLA nanoparticles. As a targeting moiety, polysobate 80 （T-80） can facilitate BMECs targeting of PLA nanoparticles.     

高糖对脑微血管内皮细胞活力和内皮素-1的影响

目的：探讨体外培养条件下高糖状态对大鼠脑皮质微血管内皮细胞（Brain microvascular endothelial cells，BMEC）的影响。方法：建立大鼠脑皮质微血管内皮细胞体外培养模型，用透射电镜观察正常浓度（5．05mmol／L）和高浓度（15mmol／L、30mmol／L）葡萄糖培养基中培养24h后内皮细胞的超微结构变化，用MTT法评价内皮细胞活力，采用放射免疫方法测定内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）含量，用原位杂交法测定ET-1mRNA表达。结果：高浓度葡萄糖可使内皮细胞超微结构损伤，细胞活力降低，ET-1分泌显著上调，并呈剂量依赖性损伤细胞，但ET-1mRNA表达无明显变化。结论：高糖对脑皮质微血管内皮细胞有显著的损伤作用，ET-1升高在糖尿病微血管病变早期可能起主要作用。