一种更有效的肝癌靶向性条件复制型腺病毒的构建及体外抑瘤作用

目的:分别构建以甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)300bp启动子和800bp增强子-300bp启动子调控复制的条件复制型腺病毒(CRAd),对两种病毒的务件复制性以及溶瘤作用进行比较,为肝癌靶向性治疗提供更优良的载体.方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,通过检测报告基因EGFP和luciferase的表达鉴定启动子和增强子的活性后,构建穿梭质粒pDC311-AFPp-E1A,pDC311-AFPep-E1A并包装出腺病毒Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A.利用Western blot、病毒增殖、细胞病变、细胞活力等鉴定并比较两种病毒的复制能力和溶瘤作用.结果:Ad.AFep-E1A和Ad.AFPep-E1A均可在AFP阳性细胞中选择性复制并且具有一定的溶瘤作用,以后者的选择复制性和溶瘤性更为明显.感染病毒Ad.AFPp-E1A后的HepG2、Hep3B细胞的存活率分别为(54.23±7.13)%、(61.18±12.63)%;感染病毒Ad.AFPep-E1A后的HepG2、Hep3B细胞存活率分别为(26.65±5.43)%、(24.49+3.31)%.结论:被截短的800bp增强子片断,在对AFP启动子起到增强作用的同时,可以为腺病毒包装进更多的治疗基因提供空间,从而为肝癌靶向治疗提供更为良好的条件复制型病毒载体.     

条件复制腺病毒的构建

条件复制腺病毒是针对第一代复制缺陷型腺病毒在临床应用中存在的问题而构建的能在肿瘤细胞特异复制的基因治疗载体。该从其构建机制、构建方式及效力评价等方面论述了为实现特异性高效复制所应考虑的诸多方面的问题,如特异性启动子的选择,基因重组方案的设计,以及相应的效力评价体系的构建等。     

溶瘤腺病毒的靶向性策略

溶瘤腺病毒靶向性研究主要集中在利用肿瘤专一性启动子控制腺病毒复制所必需的基因,以及删除或突变在正常组织中复制所必需而在肿瘤中复制所不需要的基因。该文介绍腺病毒载体的性质以及溶瘤腺病毒靶向性策略。     

人肝癌靶向性CD80基因表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人肝癌靶向性CD80基因重组腺病毒载体。方法:首先,从人基因组DNA中克隆AFP增强子、启动子,利用腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShutte-CMV,采用AFP增强子替换CMV启动子,构建含有AFP启动子和增强子的穿梭质粒,命名为pShuttle-AFP。将人CD80基因克隆到pShuttle-AFP的AFP增强子和启动子之后,构建pShuttle-AFP-CD80质粒。再将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183,利用同源重组构建腺病毒质粒pAd-AFP-CD80。以获得的重组子转染AD293细胞后制备重组腺病毒,并对重组的病毒进行鉴定和病毒滴度测定。结果:测序结果与Genebank中公布的AFP启动子、核心增强子和CD80基因序列相符。双酶切结果与预期结果相符。PacI酶切结果与目的结果一致。穿梭质粒pShutte-AFP-CD80和腺病毒质粒pAd-AFP-CD80经酶切和PCR鉴定均获得期望大小的目的片段。结论:成功的构建了人肝癌靶向性pAd-AFP-CD80腺病毒载体,为CD80基因在肝癌靶向性治疗的研究奠定了基础。     

靶向Wnt信号的溶瘤腺病毒抑制肝癌干细胞研究

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大癌症并成为癌症死亡的主要原因,传统治疗早期肝癌取得了一定的进展,但是癌症的复发、转移和耐药仍未得到根本解决,这些现象可通过癌症干细胞理论(cancer stem cell,CSC)进行解释.本研究通过悬浮富集培养的方法,获得了MHCC-97H细胞的三维立体球细胞(sphere cell),并检测其干细胞特性,通过删除5型腺病毒的E1A CR2区域24 bp碱基,并用Wnt活性转录元件TCF/TEF调控E1A基因表达,同时插入抗癌基因TSLC1,得到了双靶向溶瘤腺病毒Ad.wnt-E1A(△24 bp)-TSLC1,通过MTT、结晶紫染色实验、Hoechst、细胞划痕、蛋白质印迹技术、Transwell及免疫荧光技术检测重组病毒对肝癌类干细胞的EMT(epithelial-mesenchymal transition)转化、杀伤、凋亡以及迁移的作用.结果表明,悬浮富集培养的MHCC-97H sphere细胞具有自我更新、分化能力、静息性以及耐药性,高表达肝癌干细胞表面标志物(如CD133等),重组病毒处理后表现出明显的杀伤效果及抑制细胞迁移与侵袭的特性,靶向抑制MHCC-97H sphere细胞能力更强(P0.001),且重组病毒能有效诱导肝癌类干细胞通过caspase途径发生凋亡.因此,重组病毒Ad.wnt-E1A(△24 bp)-TSLC1有可能成为靶向肝癌干细胞的治疗药物,具有一定的临床应用前景.     

静脉输注新型溶瘤腺病毒在体内复制活性与抑瘤的关系*

目的:观察新型溶瘤腺病毒M1在体内代谢的时间及对肿瘤生长的抑制作用。方法:建立人胃癌裸鼠原位移植瘤动物模型,在指定时间点处死动物,观察瘤体大小,分离原发瘤及转移瘤进行病毒滴度测定,采用免疫组化及原位杂交来检测病毒的分布和活性复制。结果:在人胃癌裸鼠原位模型上,M1经静脉输注后不仅分布于胃原发瘤,而且存在于转移灶,但用M1静脉内给药可以减缓肿瘤生长速度。结论:静脉内输注溶瘤腺病毒可以选择性的作用于肿瘤及转移灶,并发挥溶瘤和靶向灭活plk1的双重效应。     

人eNOS复制缺陷型重组腺病毒的构建

目的:构建以巨型细胞病毒(CMV)为启动子的heNCS重组腺病毒转移载体.方法和结果:将heNOS cDNA全长亚克隆到穿梭质粒启动子CMV的下游,通过I-Ceu Ⅰ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得重组腺病毒质粒DNA(pAdeno-heNOS),后者经限制性内切酶PacⅠ切割,利用脂质体转染法获得heNOS重组腺病毒.PCR双引物法鉴定是否成功构建heNCS重组腺病毒.结论:PCR双引物检测含有heNOS片段,表明成功构建了heNOS重组腺病毒转移载体AdhCMV-heNOS.     

海人藻酸受体GluK2亚基复制缺陷型腺病毒的构建

目的:构建海人藻酸(kainate,KA)受体GluK2亚基复制缺陷型腺病毒重组体。方法:以GluK2-pcDNA3.1真核表达载体为模板,经PCR扩增GluK2目的基因,然后将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,后将重组的穿梭质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共同电转入BJ5183电穿孔感受态细胞筛选阳性同源重组子。阳性重组体经限制性内切酶PacⅠ消化,经脂质体转染入HEK293细胞进行包装与扩增。接着腺病毒经大量提取纯化后进行滴度测定。结果:GluK2腺病毒具有较强的感染能力(6.75×109ifu/ml)并可表达目的蛋白。结论:GluK2复制缺陷型腺病毒成功构建。GluK2腺病毒可高效感染原代神经元及神经细胞系,为进一步研究其对神经元的调控作用奠定基础。     

非复制型腺病毒携带miR-1的表达诱导肝癌细胞凋亡

miR-1在多种肝癌细胞中被甲基化沉默,导致其下游多个癌基因MET,FoxP1,HDAC4等大量表达,促进了肝癌的增殖.本研究利用非复制型腺病毒Ad-easy携带miR-1（Ad-miR-1）在肝癌细胞PLC/PRF/5和HepG2中过表达miR-1,探讨miR-1抑制肝癌细胞的作用机制.结果表明,肝癌细胞PLC/PRF/5和HepG2中miR-1表达水平极低,感染Ad-miR-1后miR-1表达水平显著上升.肝癌细胞PLC/PRF/5和HepG2感染Ad-miR-1后,MET和FoxP1的mRNA水平和蛋白表达水平被显著下调,细胞凋亡水平显著增加,肝癌细胞的增殖被抑制. 可见,miR-1在肝癌细胞中可能是一个重要的抑癌因子.同时,利用腺病毒载体携带抗癌的microRNA（如miR-1）,也为今后的基因治疗研究提供了一种新方法.     

结缔组织生长因子基因RNA干扰复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建能介导结缔组织生长因子（CTGF）基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法：以大鼠CTGF基因为靶序列,设计并合成含编码短发夹RNA序列的寡核苷酸,构建腺病毒穿梭质粒P-shuttle-CTGF,酶切及测序分析正确后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞,进行病毒包装,得到腺病毒载体Ad．H1-CTGF,用该载体感染HSC-T6细胞,观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果：构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确;包装的病毒载体滴度为4×1010PFU／mL,感染HSC-T6细胞后,Western印迹证实CTGF表达显著减少。结论：构建的腺病毒载体Ad．H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达,为抗纤维化研究提供了有力的工具。     

Survivin介导的条件复制型溶瘤腺病毒表达IL-24蛋白对人肝癌细胞PLC作用机制探究

条件复制型溶瘤腺病毒Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24对人肝癌细胞株PLC的作用机制尚不清楚。采用流式细胞仪检测PLC经PBS、Ad.sp-E1A_((△24)以及Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24处理48h后细胞周期的变化;利用Western blot检测PLC经PBS、Ad.sp-E1A_((△24)以及Ad.sp-E1A_((△24)IL-24处理24 h、48h后细胞中凋亡信号相关蛋白表达量的变化。实验结果表明:Ad.sp-E1A_((△24)和Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24能将PLC细胞周期阻滞在S期,其值分别为43.74%±6.61%,49.48%±7.60%,两者与未感染病毒的对照组(18.91%±1.83%)进行统计学差异分析,P值均0.05;同时,Western blot检测发现随着处理时间的增加,病毒处理组中CHOP的表达量、caspase 12的剪切水平及STAT3、p38 MAPK的磷酸化水平都有明显提高,尤其以Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24处理组较为明显。SOCS3的表达量病毒处理组与对照组没有显著差异。上述结果表明重组腺病毒Ad.sp-E1A_((△24)-IL-24能有效阻滞PLC细胞周期在S期,并可能通过内质网压力、STAT3与MAPK信号通路等多种途径诱发PLC细胞凋亡。     

携带TSLC1基因的双靶向溶瘤腺病毒联合阿霉素对SMMC-7721肝癌细胞的杀伤作用

研究携带TSLC1基因的溶瘤腺病毒(Ad.sp-E1A(24)-TSLC1)联合化疗药物阿霉素(adriamycin,ADM)对SMMC-7721肝癌细胞的体外杀伤作用。实时定量PCR检测TSLC1在不同肝细胞中的表达情况;用荧光显微镜观察阿霉素、Ad.sp-E1A(24)-TSLC1单独作用和两者联合作用的细胞形态学的变化;采用MTT法、结晶紫染色、Hoechst33342染色检测各处理组细胞的存活率和凋亡水平情况;通过Western blot检测TSLC1和E1A蛋白水平的表达。结果表明,联合应用Ad.sp-E1A(24)-TSLC1和阿霉素的细胞凋亡现象比单独作用的效果显著,表明阿霉素能够增强携带TSLC1基因的溶瘤腺病毒对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用,为肝癌治疗的临床应用奠定一定基础。     

携带OX40L重组溶瘤病毒的构建及靶向杀伤肝癌的研究

目的 拯救携带OX40L的重组溶瘤流感病毒株，全面鉴定并评价其靶向杀伤肝癌细胞的效果。方法 将编码OX40L的基因片段嵌合在A/PuertoRico/8/34（PR8）的NS片段特定位置，利用反向遗传学技术（reverse genetics，RG），与PR8流感病毒的剩余7个骨架质粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M共转染COSⅠ/MDCK细胞，成功拯救获得重组溶瘤流感病毒，命名为rFlu-OX40L。经血凝、TCID₅₀方法测定病毒滴度；重组病毒纯化后电镜观察病毒形态特征及大小分布；检测MDCK细胞病毒生长曲线；MTS法检测重组病毒对肝癌细胞活力的影响；流式细胞术检测重组病毒诱导肝癌细胞死亡方式；利用肝癌荷瘤小鼠模型评价重组病毒rFlu-OX40L在动物体内的抗肿瘤效果。结果 重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L可在鸡胚中稳定传代，HA效价达2^7~8，病毒滴度可达 7~8 LgTCID₅₀/ml；重组病毒rFlu-OX40L与流感病毒PR8生长曲线相一致，72 h达高峰；MTS结果显示，3 MOI重组病毒可显著降低肝癌细胞活力，且对正常肝细胞无明显影响，呈时间和剂量依赖性；流式细胞结果显示，重组病毒可显著诱导肝癌细胞凋亡，呈时间和剂量依赖性；利用肝癌荷瘤小鼠模型，瘤内注射重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L较PR8、PBS对照组，小鼠脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、CD69+ T细胞数量呈现显著升高趋势。结论 携带OX40L的重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L在体内外均可选择性杀伤肝癌细胞，有望为肝癌的临床治疗提供新的免疫治疗策略。     

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT-PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAd Track-MV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E．coli BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1：10000和1：1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100％。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。     

一种新型DHA复合物的抑瘤作用及对Caspase-3凋亡蛋白表达的影响

目的评价一种新型DHA复合物（AT-158）对荷瘤小鼠移植瘤及体外培养肿瘤细胞的抑瘤作用,并对其可能的作用机制做初步探讨。方法建立移植瘤荷瘤小鼠动物模型和体外细胞培养的方法,评价AT-158在体内和体外的抑瘤作用,观察体外培养的Hela细胞在药物作用下的核形态的改变,测定移植瘤中Caspase-3凋亡蛋白表达的变化。结果AT-158在体内和体外均显示显著的抑瘤作用。肿瘤细胞的核形态发生凋亡细胞特征性改变。诱导凋亡执行蛋白Caspase-3表达增加。结论AT-158显示一定的抑瘤效果,具有较高的开发价值。     

双靶向溶瘤腺病毒MD55对肿瘤细胞与正常细胞的杀伤作用比较

应用分子克隆和同源重组技术构建双靶向溶瘤腺病毒MD55.分析MD55病毒在细胞中的复制能力,并用MTT和结晶紫方法检测MD55对肿瘤细胞和正常细胞生长的影响,West-ern印迹检测病毒感染后细胞中E1A蛋白和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片断的表达.结果显示,MD55能在MN/CA9阳性的肿瘤细胞SW620和OSRC-2中特异性表达E1A蛋白.并且在这些细胞中的复制能力和对这些细胞的杀伤性与对照病毒ZD55基本相同,而其在正常细胞中的复制能力很弱,对正常细胞的伤害很小;同时MD55可诱导肿瘤细胞SW620和OSRC-2的凋亡,而对正常细胞的凋亡无影响.实验结果表明双靶向溶瘤腺病毒MD55靶向性和安全性比单靶向病毒ZD55更高,有望成为一种很好的肿瘤靶向基因一病毒治疗载体.     

人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV)基质蛋白（matrix protein,M）在RSV形态发生上具有重要作用,因含有CTL抗原表位,在疫苗研究上具有一定意义。为此,应用RT-PCR 方法从感染RSV的HEp-2 细胞中扩增获得M蛋白基因,构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。非复制型重组腺病毒DNA分子FGAd/RSVM转染293细胞,观察到细胞出现CPE,RT-PCR发现M基因有转录,Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。