龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达

以龙眼体胚发生早期的胚性培养物为材料,通过简并引物结合PCR进行cDNA末端快速克隆(RACE)的技术,克隆到了龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5全长序列,其cDNA全长为887 bp,由681个核苷酸组成的开放阅读框,编码226个氨基酸(GenBank登陆号为GQ443759).该基因推导的蛋白分子质量为24511.9 u,理论等电点pI为9.65;该蛋白是Frigi-da-like蛋白质家族成员,是一个具有Frigida组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,并且主要集中在C端区域.实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,呈"N"形趋势,其中以不完全胚性紧实结构阶段最高,而鱼雷形胚阶段表达量最低;方差分析表明,鱼雷形胚阶段DlUP-5基因表达量与其他7个阶段存在极显著差异.该研究结果对DlUP-5基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼胚性愈伤组织胚胎发生能力、早期体胚正常发育和体胚成熟过程等方面可能起重要作用.     

不同胚性愈伤率小麦胚发育过程生化和显微结构特征研究

为探究不同胚性愈伤率小麦成熟胚的胚发育过程中的生化和显微结构特征,以不同胚性愈伤率的小麦基因型为材料,测定花后16、30 d小麦胚中的糖类、激素和活性氧的含量。结果显示,较高胚性愈伤率基因型小麦花后30 d麦胚的赤霉素含量显著大于低胚性愈伤率型,而其他生化指标在2个发育阶段差异不显著。相关性分析发现,30 d胚的赤霉素含量与胚性愈伤率呈极显著正相关,说明高胚性愈伤率的小麦胚可能在发育晚期具有较高的赤霉素含量。在对胚内部结构观察中,并未发现2个发育阶段不同小麦胚之间存在明显差异。     

龙眼胚性愈伤组织体胚发生同步化调控及组织细胞学观察

以龙眼“红核子”胚性愈伤组织为材料 ,对龙眼体细胞胚胎发生进行同步化调控 ,并采用石蜡切片进行组织形态学观察 .结果表明 ,通过控制培养基中 2 ,4-D质量浓度可以调控龙眼体胚的发育进程 ;龙眼胚性愈伤组织的胚胎发生一般是内起源 ,且起源于单细胞     

龙眼胚性愈伤组织AGO6基因克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

依据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,利用RT-PCR结合RACE技术,以龙眼胚性愈伤组织c DNA为模板,获得Dl AGO6基因的c DNA全长序列,共3 168 bp(登录号为KF819529),完整开放阅读框2 700 bp,编码900个氨基酸。生物信息学分析表明:Dl AGO6的c DNA所编码的氨基酸序列含有2个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与拟南芥AGO6蛋白序列有较高的同源性。龙眼体胚发生过程中Dl AGO6表达量的q PCR分析表明:Dl AGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织时期的表达量最高,在鱼雷形胚时期表达量最低,推测DLAGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织阶段的高表达量,可能与细胞的旺盛分裂有关。     

栓皮栎体胚再生与增殖能力的保持研究

【目的】提高栓皮栎体胚的再生与增殖能力。【方法】将栓皮栎不同发育阶段合子胚诱导的胚性愈伤组织及不同发育时期的体胚,分别接种于含不同组合激素的MS培养基上,在不同光照条件下培养,探讨影响栓皮栎体胚再生与增殖能力保持的因素。【结果】随着继代次数的增加,胚性愈伤组织再生体胚能力呈下降趋势;6-BA与NAA配合使用可延缓继代过程中胚性愈伤组织再生体胚能力的下降,1.00mg/L 6-BA与0.25mg/L NAA是继代中保持胚性愈伤组织再生体胚能力的最佳培养基激素组合;胚性愈伤组织再生体胚需要自然散射光,强光及全程暗培养均不利于体胚再生;合子胚外植体发育程度影响胚性愈伤组织再生体胚能力,处于心形期及早子叶形期的幼嫩合子胚诱导的胚性愈伤组织,其再生体胚能力强于成熟子叶形合子胚诱导的胚性愈伤组织;体胚发育阶段越老,再生与增殖体胚能力越差,胚性愈伤组织及处于球形期的体胚,再生增殖体胚能力强于其他发育时期的体胚。【结论】选择处于心形期的幼嫩合子胚诱导胚性愈伤组织,然后在含1.00mg/L 6-BA与0.25mg/L NAA的MS培养基上于自然散射光下培养,可有效保持栓皮栎的体胚再生与增殖能力。     

龙眼体胚发生过程中tRNA怀丁苷合成蛋白基因(Dltyw1)的克隆及表达分析

根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库信息,进行龙眼胚性愈伤组织tRNA怀丁苷合成蛋白基因(Dltyw1)cDNA全长克隆及其在体胚发生过程中的定量表达分析.结果表明:Dltyw1基因全长2273 bp,包含1920 bp ORF,编码640个氨基酸,将此基因登录GenBank,登录号为JF733783;Dltyw1含有flavodoxin 1、Radical SAM及Wyosine form功能域,进化树分析显示,Dltyw1与其他物种twy1基因具有较高同源性.荧光定量PCR技术分析表明,Dltyw1基因在龙眼体细胞心形胚时期呈现表达高峰,并在子叶形胚阶段迅速下降至最低点,由于心形胚是体细胞胚胎发生由球形胚向各组织器官发育的关键阶段,表明twy1基因在体胚发生过程中的组织器官发育及形态建成阶段的转录后调控方面起重要作用.     

限制生长保存龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程的RAPD分析

以红核子龙眼不同保存时间(5个月、3 a、13 a)的不同发育阶段体胚为材料,对限制生长保存后的胚性愈伤组织(EC)的体胚发生过程进行随机扩增多态性DNA(RAPD)分析;筛选10条随机引物,对EC不同发育阶段体胚的基因组DNA进行扩增.结果表明:龙眼EC不同发育阶段体胚的RAPD谱带存在一定的差异,但不同保存时间的EC在体胚发生过程中的相对变异率都保持在比较小的变异范围内,小于5.1%.     

龙眼体细胞胚发生中期的蛋白质组学研究

 【目的】了解龙眼体细胞胚发生中期（球形胚至子叶形胚）蛋白质组的变化,为进一步阐明植物体细胞胚发生的机制提供依据。【方法】进行龙眼体细胞胚发生中期的同步化调控,采用双向电泳和质谱对龙眼体细胞胚发生中期的蛋白质组变化进行分析。【结果】龙眼体细胞胚发生中期表达蛋白的种类随着体细胞胚的发育逐渐减少,但在鱼雷形胚阶段其种类数量有所回升,且增加的蛋白分子质量小于66.0 kD,pI主要集中在5.00—7.00。成功鉴定了35个差异蛋白,发现了多个与体细胞胚发生密切相关的蛋白。1/2以上的蛋白与代谢途径有关,多个蛋白与氧化胁迫有关。RAN2 和 GTPase ObgE在龙眼体细胞胚发生中期发生了活跃的变化。【结论】随着体细胞胚的发育,细胞不断分化,体细胞胚中表达的蛋白种类减少。氧化胁迫相关蛋白、RAN2 和 GTPase ObgE与龙眼体细胞胚发生的调控有关。     

龙眼胚性愈伤组织LEC1基因cDNA克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织Leafy Cotyledon 1(LEC1)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(简称体胚)发生过程中的表达情况.采用RT-PCR结合RACE法及TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织LEC1基因的cDNA全长序列,运用生物信息学方法对该序列...     

龙眼胚性愈伤组织的高频率体细胞胚胎发生

比较了龙眼不同类型胚性愈合伤组织，品种，蔗糖质量浓度，有机附加物，生长调节剂，光照度等因素对龙眼胚性愈组织体胚诱导的影响，结果表明，在优经的体胚发生条件下，选择适宜的胚性愈伤组织类型，可获得龙眼胚性愈伤组织的高频率体细胞胚胎发生，在低质量浓度蔗糖（≤３０ｇ．Ｌ＾－１）和黑暗条件下，松散型胚性愈伤组织的体胚分化频率为１００％，并且发生数量可达每克１万个左右。     

龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组学

【目的】通过龙眼（Dimocarpus longan Lour.）体细胞胚发生早期5个阶段的蛋白质组学研究,为植物胚胎发育相关蛋白基因分离和植物体细胞胚发生相关机制等的深入研究奠定基础。【方法】利用已建立的龙眼体细胞胚发生再生系统,经同步化培养获得龙眼体细胞胚发生早期5个阶段胚性培养物,并采用双向电泳和质谱技术对龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组变化进行分析。【结果】龙眼体细胞胚发生早期5个阶段的蛋白质2D表达谱可检测到1 203-1 798个蛋白点,其在龙眼体细胞胚发生早期各阶段大部分具有阶段差异表达特性,有小部分是阶段特异表达,根据其蛋白数目、表达丰度、分子量和等电点等变化,确定了龙眼体细胞胚发生早期的ECII到CpECGE阶段是体细胞胚发生早期的关键性阶段。成功鉴定45个差异蛋白,成功率为37%,其中以能量、碳水化合物代谢相关蛋白和氧化胁迫反应相关蛋白占多数,分别为22%和27%;通过其功能分析可以推断出,龙眼体细胞胚发生早期,能量和糖代谢是体细胞胚发生的基础,而氧化胁迫反应是体细胞胚发生的先决条件,并通过参与细胞骨架的稳定、氮代谢、信号转导、基因调控、蛋白质的翻译加工修饰和定位等功能的蛋白,构成一个庞大的龙眼体细胞胚发生蛋白质调控网络系统,保证体细胞胚的正常发育。【结论】对龙眼体细胞胚发生早期过程的蛋白质表达变化有了较全面的了解,蛋白质表达数量呈先减低后升高再减低的趋势,龙眼体细胞胚发生早期能量和糖代谢旺盛,氧化胁迫反应相关蛋白对体细胞胚早期的发生和发育有重要的调控作用。     

龙眼胚性培养物APX同工酶的分析方法建立及其在龙眼体胚发生过程中的变化

以龙眼胚性培养物为材料,进行抗坏血酸过氧化物酶(APX)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法研究,建立一套适合分离龙眼胚性培养物中不同类型APX同工酶的垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法;进一步研究了APX同工酶在龙眼体胚发生过程中的变化,发现在胚性愈伤组织、球形胚、子叶形胚3个阶段APX同工酶存在差异.     

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸。该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高。对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支。qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高。【结论】龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高。     

龙眼体细胞胚胎发生过程中内源多胺的变化

采用高效液相色谱测定了龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中内源多胺含量的变化.结果表明:龙眼胚性愈伤组织中内源多胺含量比非胚性愈伤组织高;体胚发生过程中内源多胺含量变化趋势大致呈“M”状,在胚性愈伤组织Ⅱ和球形胚阶段转折;内源多胺含量的变化先于形态学的变化.     

龙眼体胚发生中期发育同步化的初步调控

试验以龙眼"红核子"胚性愈伤组织为材料,对龙眼体细胞胚胎发生进行同步化调控,2,4-D浓度为0.07mg/L时获得了心形胚,2,4-D浓度为0.05mg/L和0.06mg/L时获得了鱼雷形胚,2,4-D浓度为0mg/L时获得了高度同步化的子叶形胚。研究表明,通过培养基中2,4-D浓度的微量调整,基本能够控制龙眼体胚发育中期心型、鱼雷形胚的发育同步化。     

龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中生物大分子的动态变化

测定了龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中若干生物大分子的动态变化.结果表明:龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中淀粉有2个累积峰值,第1次出现在胚性愈伤组织阶段,第2次出现在球形胚阶段,在鱼雷形胚阶段又有一个小回升,这时淀粉积累较心形胚和子叶形胚阶段高一些;随着胚胎的发育,DNA、RNA、总核酸含量的变化趋势大致相同,最高点均出现在心形胚阶段,其中RNA含量的变化较DNA、总核酸含量明显,蛋白质含量的变化曲线呈“S”形.这些生物大分子的动态变化表明,它们对于体胚的发生和发育起着重要作用.     

龙眼胚性培养物蛋白质水平双向电泳技术体系的建立

以龙眼胚性培养物为材料,使用Pharmacia多功能水平电泳仪(Multiphor ),采用滤纸半干电泳与梯度凝胶技术,建立了适合于龙眼胚性培养物的蛋白质水平双向电泳技术体系.使用该技术有望对龙眼体细胞胚胎发生过程中特异蛋白进行研究.     

香榧幼胚发育与胚性感受态之间的相关性

以突破种鳞第8周至第15周种子的香榧Torreya grandis ‘Merrillii’幼胚为外植体,研究了香榧幼胚胚龄、生长素等对香榧胚性愈伤组织以及体细胞胚直接发生的影响,筛选出高胚性感受态的香榧幼胚胚龄,并根据幼胚内源吲哚乙酸（IAA）和脱落酸（ABA）质量分数检测结果,初步确定了高胚性感受态的香榧幼胚生理特点。结果表明:在SH附加0.1 mg·L-1 NAA培养基中培养,第9周幼胚的胚性愈伤组织发生率最高,为48.3%,第10周幼胚的体胚直接发生率最高,为42.7%;而培养于SH基本培养基中的第14周幼胚直接萌发率最高,为65.1%。香榧不同胚龄幼胚内源ABA及IAA质量分数检测结果表明:不同发育时期香榧幼胚的内源IAA及ABA质量分数具显著差异（P < 0.05）。其中香榧第8周幼胚内源IAA的质量分数最高,为53.90 ng·g-1,随着胚龄的逐渐增加,内源IAA质量分数呈下降趋势,第15周内源IAA质量分数最低,为35.60 ng·g-1。内源ABA质量分数随着胚龄的增加呈先缓慢下降,再快速上升,后下降,其中第15周达到最大值,为160.20 ng·g-1。通过对香榧幼胚离体培养及内源激素的测定,发现香榧第8~12周幼胚具有较高的胚性感受态。该研究结果对维持香榧幼胚高胚性感受态,开展香榧胚性愈伤组织及体胚发生培养条件的优化提供了技术指导。