pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达**

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比

背景：目前组织工程骨构建研究中的种子细胞主要来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织,近年来的研究多集中于骨髓基质细胞。而脂肪中基质细胞的发现,有望取代骨髓基质细胞。 目的：观察体外培养脂肪基质细胞与骨髓基质细胞的生物学特性,并比较二者成骨诱导后的碱性磷酸酶活性,从成骨活性方面来评价脂肪基质细胞能否取代骨髓基质细胞。 方法：手术中收集同一人体的脂肪组织与骨髓组织。脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪基质细胞,骨髓组织以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓基质细胞;体外培养、传代后以诱导培养液行成骨诱导培养。诱导后第2,3周各检测1次细胞中的碱性磷酸酶活性,并行Von Kossa钙结节染色鉴定成骨细胞。 结果与结论：共获得15例患者的脂肪与骨髓组织,其中10例完成实验。与骨髓基质细胞相比,脂肪基质细胞更易培养成活,扩增速度快;二者细胞形态相似,诱导培养后细胞外基质中均有黑色的钙结节形成;碱性磷酸酶活性二者差异无显著性意义(P > 0.05)。结果提示脂肪组织来源丰富,脂肪基质细胞成活容易,具有与骨髓基质细胞相似的生物学性能,且易培养、增殖快,二者的成骨活性相似,脂肪基质细胞比骨髓基质细胞更具有优势。     

离心力对兔骨髓基质细胞成骨分化的影响*

背景：在骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中,离心力是一种促进因素。 目的：探讨离心力是否能促进复合于聚羟基乙酸共聚物材料上的兔骨髓基质细胞向成骨方向分化。 方法：全骨髓法分离培养兔骨髓基质细胞,贴壁法纯化,至细胞达80%融合时胰酶-EDTA消化传代,调整细胞浓度为1× 109 L-1。将聚羟基乙酸共聚物切割成5 mm×5 mm大小,预先浸泡入含血清培养基内24 h,然后将第3代骨髓基质细胞悬液按300 μL/块密度接种于支架材料表面,将复合物置入离心管底,细胞滴加面朝上,加入含抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松的成骨诱导培养基。设立2组：离心力刺激组每间隔12 h将离心培养管置于离心机上,按1 000 r/min离心30 min,相对离心力132 g;对照组培养管中细胞不作离心静态培养。通过光镜观察及检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、组织钙含量,评估成骨细胞的分化水平。 结果与结论：体外培养第16天,离心力刺激组支架表面被多层细胞和矿化基质所覆盖,而对照组仅支架表层见一薄层细胞。与对照组比较,离心力刺激组培养后第2天碱性磷酸酶活性明显降低(P < 0.05),第4天碱性磷酸酶活性明显升高(P < 0.05)。在整个培养期间对照组骨钙素质量浓度一直维持低水平,离心力刺激组第12,16天骨钙素质量浓度明显高于对照组(P < 0.05)。培养16 d后离心力刺激组的钙质量浓度明显高于对照组(P < 0.05)。提示离心力能促进接种于聚羟基乙酸共聚物的兔骨髓基质细胞成骨分化,并形成矿化产物。     

重组人骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子联合促进兔骨髓基质细胞血管内皮细胞生长因子表达及其成骨潜能

背景：了解在体外或体内环境下,应用重组人骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子,能否达到既加强成骨又促进血管内皮细胞生长因子表达的双重作用。 目的：观察兔骨髓基质细胞经重组人骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子刺激后,其血管内皮细胞生长因子表达及成骨潜能的变化。 方法：取兔双侧股骨骨髓基质细胞,采用骨髓基质细胞体外培养技术,单独或联合以重组人骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子刺激细胞。细胞培养5 d后,进行细胞形态、增殖情况、碱性磷酸酶活性、成骨结节、血管内皮细胞生长因子阳性细胞率等项目的检测。 结果与结论：联合先后应用重组人骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子在细胞计数、碱性磷酸酶活性、矿化面积百分率、血管内皮细胞生长因子阳性细胞率4个检测项目上优于同时应用重组人骨形态发生蛋白2或碱性成纤维细胞生长因子以及单独应用重组人骨形态发生蛋白2或碱性成纤维细胞生长因子。结果表明合理的联合使用重组人骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子,不仅可促进骨髓基质细胞的快速增殖及向成骨细胞转化,还可促进促血管内皮细胞增生的重要介质血管内皮细胞生长因子的表达。     

RNA干涉抑制破骨细胞分化因子表达对骨髓基质细胞成骨成脂分化的影响

背景：RNA干涉是目前分子生物学研究领域重要的基因下调技术,护骨素/κB受体活化因子/破骨细胞分化因子偶联系统是目前骨改建平衡研究中的热点。 目的：应用RNA干涉特异性抑制大鼠骨髓基质细胞内破骨细胞分化因子基因的表达,研究破骨细胞分化因子表达下调后对骨髓基质细胞成骨成脂分化的影响。 方法：获取骨髓基质细胞,转染前24 h按5×105/孔接种于6 孔培养板中,分为实验组、阴性对照组和空白对照组,前2组细胞分别转染针对破骨细胞分化因子的siRNA或阴性对照siRNA。观察骨髓基质细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性及Real-Time PCR检测成骨成脂基因mRNA的表达。 结果与结论：实验组碱性磷酸酶活性降低,RunX-2,骨形态发生蛋白2,4表达降低,而PPAR-γ和C/EBP-α的表达升高(P < 0.05)。提示,通过RNA干涉使骨髓基质细胞的破骨细胞分化因子表达下调对骨髓基质细胞成骨分化有抑制作用,而对成脂分化有促进作用。     

脂质体介导pcDNA3/hVEGF165转染骨髓基质干细胞复合冻干骨的体内成骨和血管化☆

背景：以往的研究表明血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子可以促进移植物的存活和体内生长。 目的：观察脂质体介导的pcDNA3/hVEGF165转染骨髓基质干细胞后复合冻干松质骨在体内的成骨和血管化效果。 方法：取同种异体新西兰大白兔的耾骨和股骨制备冻干骨,用脂质体将血管内皮生长因子转染入体外培养扩增新西兰大白兔骨髓基质干细胞中,使其附着于同种异体冻干松质骨。将新西兰大白兔分为3组,于兔竖脊肌分别植入单纯冻干骨、单纯骨髓间充质干细胞复合冻干骨组、转染有血管内皮生长因子的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨。 结果与结论：植入后8周时可见到转染血管内皮细胞生长因子的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨标本的表面有软骨和骨质形成,有成骨和破骨细胞出现,并形成类骨质,在移植骨周围组织中有大量血管形成,其他两组仅有大量纤维包裹。说明,脂质体介导的pcDNA3/hVEGF165转染后骨髓基质干细胞复合冻干骨具有较好成骨活性,优于单纯骨髓基质干细胞复合冻干松质骨和单纯冻干骨。     

猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体兔体内成骨☆

目的：生物衍生骨具有天然骨组织的三维立体孔隙-网架结构，有利于种子细胞的黏附、增殖。观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解。 方法：实验于2005-03/2006-12在中南大学湘雅医院中心实验室完成。选择健康家兔16只，3月龄左右，其中1只提供骨髓，另15只作组织工程骨植入，分4，8，12周3个时间点，每个时间点5只。采用Ficoll密度梯度离心法得到兔骨髓基质干细胞并诱导培养；采用物理化学方法对猪松质骨进行处理得到猪松质骨支架，与经诱导培养的骨髓基质干细胞体外复合培养后植入机体内，同时植入单纯猪松质骨支架做自身对照。 结果：纳入动物15只，均进入结果分析。采用X射线、苏木精-伊红染色、Masson三色染色及图像分析观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解。①X射线观察：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体移植术后4周移植区周围可见少量散在分布的中密度影，8，12周时中高密度影逐渐向中心区增大。单纯猪松质骨支架移植术后各时间点移植区内均呈低密度影。②组织学观察：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后4周开始有新骨生成，支架开始降解；8周时新骨的形成及支架的降解都明显增加；12周时新骨继续增加，逐渐向成熟骨组织转变，可见少量哈佛系统，但骨小梁尚不典型，毛细血管增生明显，少量支架残留，未见炎症细胞。单纯猪松质骨支架植入后各时间点无新骨形成。③图像分析表明：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后新骨组织随时间延长而增加，而材料组织随时间延长而减少，但新生骨组织增加与支架材料组织减少无明显直线相关（P > 0.05）。 结论：猪松质骨支架与骨髓基质干细胞复合移植后新骨逐渐形成，支架逐渐降解，是一种较理想的骨组织工程支架材料。     

兔骨髓基质细胞的体外培养及鉴定

背景：骨髓基质细胞的分离纯化、细胞培养、细胞标记、诱导因子、基因转染对细胞生物学影响、细胞载体构建及细胞复合物回植时间的选择等尚处于实验研究阶段。 目的：摸索一种较为简便且可有效获得骨髓基质细胞的体外培养方法。 设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2006-06/2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成。 材料：SPF级6周龄新西兰大白兔8只，由中国科学院遗传发育研究所实验动物中心提供。 方法：无菌条件下抽取兔骨髓1 mL，D-Hanks液稀释后，离心弃上清，DMEM培养基重悬，制备单细胞悬液，叠加在密度为1.077的等体积淋巴细胞分离液的液面上，离心后取界面云雾状的单个核细胞层，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬。以1×10/cm2接种后贴壁法纯化细胞，待70%~80%长满单层后消化传代。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞生长情况，锥虫蓝染色计数活细胞，苏木精-伊红染色对细胞进行鉴定，MTT法检测细胞活性，观察传代培养的细胞冻存后复苏情况。 结果：接种24 h后细胞开始贴壁，呈短梭形或三角形，且有长短不等的细胞突起；3 d后贴壁细胞开始分裂增殖，部分区域形成细胞团簇；1周后大部分细胞呈成纤维状散落在培养瓶底生长；传代后细胞均匀分布，形态呈细长梭形，并沿一定方向排列，1 mL骨髓基质细胞悬液传3代后的贴壁细胞数可达5×106~1×107数量级。骨髓基质细胞成活率约为90%，经鉴定为单核细胞，接种后1~6 d细胞持续旺盛生长，至第8天细胞活性最高，随后生长活性下降。复苏冻存56 d的细胞，其生长良好，增长迅速。 结论：以淋巴细胞分离液梯度离心后可获得纯度较高的骨髓基质单核细胞，经体外扩增培养能够得到足够数量的种子细胞，冻存复苏后细胞活性无变化。     

冻存骨髓基质细胞复合材料体内成骨基质的合成能力

摘要背景: 课题组以往研究显示：体外培养条件下,冻存骨髓基质细胞复苏后仍保持较高的细胞存活率、细胞增殖及成骨分化能力。上述结果仍然需要进一步在体内环境下证实。目的：观察经超低温冻存后的骨髓基质细胞和支架材料胶原膜BME-10X复合体植入裸鼠体内后Ⅰ型胶原的合成情况。方法：体外分离培养Beagle犬骨髓基质细胞,冻存12个月后复苏,体外构建骨髓基质细胞和胶原膜材料复合体。分别经矿化诱导培养液、基础培养液培养5 d后,植入裸鼠体内,于术后第4周取出标本,进行大体观察、组织病理学和免疫组化分析,并应用图像分析系统对各组标本中的Ⅰ型胶原进行定量分析。以矿化诱导培养液培养的单纯胶原膜材料为对照组。结果与结论：对照组在植入胶原膜后,胶原膜边界清晰,膜边缘及内部基本没有细胞生长,Ⅰ型胶原分布很少;在未诱导矿化组,术后第4周可见,胶原膜内有细胞长入,并有细小的条索状新生胶原形成,Ⅰ型胶原分布明显增多;在诱导矿化组,植入后也可见支架材料的分解降解和更多的细胞生长,大量新生的胶原形成类骨质样组织,与前两组对比,Ⅰ型胶原分布增多有显著性意义。结果表明冻存骨髓基质细胞复苏后进行体外培养扩增与诱导分化,并在体内环境下复合胶原支架材料,仍然具有较强成骨能力。关键词：骨髓基质细胞;胶原膜;免疫组化;裸鼠;成骨能力     

富血小板血浆诱导人骨髓基质干细胞的体内异位成骨**☆

背景：近年来的研究发现,结合组织工程技术利用经诱导转化的骨髓基质干细胞能成功地在动物体内再生出骨组织,并在大型哺乳动物负重骨缺损的修复实验中取得了较好的修复效果。 目的：观察富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞在体内的成骨特性,探讨采用富血小板血浆诱导培养的人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料体内异位成骨的可行性。 设计、时间及地点：配对样本观察,于2007-10/2008-04在中山大学组织工程实验室完成。 材料：4周龄BALB/C裸鼠14只,体质量22~24 g,麻醉后将裸鼠两侧股部切开,于股部肌间隙内制成肌袋模型。 方法：14只裸鼠左侧肌袋内植入珊瑚羟基磷灰石复合富血小板血诱导培养的人骨髓基质干细胞,作为实验组;右侧背部肌袋内植入单纯珊瑚羟基磷灰石材料为对照组。 主要观察指标：分别于植入后4,8,12周对比观察两组裸鼠活动及进食情况;X射线平片观察阻射率;苏木精-伊红染色观察骨形成情况。 结果：14只裸鼠均进入结果分析。①植入材料后裸鼠活动及进食均正常,伤口愈合良好。材料随植入时间的延长无明显吸收,而材料周围的肌肉组织等软组织由外向内逐渐长入材料孔隙内有所增多。②随时间延长两组X射线平片阻射影像密度逐步增加。植入材料后4,8,12周实验组与对照组相比,差异有非常显著性意义(P < 0.01)。③植入材料后4周,实验组可见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长,孔隙内有结缔组织长入;对照组仅见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长。8周时珊瑚羟基磷灰石表面有新生骨形成,孔隙内和孔隙边缘可见骨样组织沉积和少量软骨样组织形成;对照组仅见少量纤维结缔组织长入。12周时珊瑚羟基磷灰石材料表面有较多成熟编织骨形成,部分区域可见髓腔样结构形成,并有血管长入;对照组仍未见新骨及骨样组织形成。 结论：富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料在裸鼠体内能够良好的成骨,随时间的延长,成骨特性越明显;体内采用肌袋包裹的方法能有效增加血运及促进组织工程骨血管化生成,促进成骨。     

脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力*☆

背景：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞具有很多相似的生物学特性。 目的：比较脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞与受损PC12细胞分别共培养后定向分化能力的差异。 方法：分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的基质干细胞,取第5代细胞进行实验,2种细胞分别与正常或受损PC12细胞培养上清液共培养,或仅单独培养。 结果与结论：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞均表达较高水平的CD44和CD29,而后者表达的CD45、CD56在前者几乎未检测到。单独培养的2种细胞均表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性烯醇酶。其中经受损PC12细胞干预的2种细胞Nanog、Oct4、Sox2表达水平显著降低,而脂肪基质干细胞中神经元特异性烯醇酶阳性细胞数更多,提示受损PC12细胞对于脂肪基质干细胞可能具有更强的诱导分化作用。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景：骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织。 目的：体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成。 材料：选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨。 方法：自犬肋骨取骨髓2.0~3.0 mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养。8~11 d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1∶3接种传代。取第3代细胞培养扩增,换液时加入10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子2 mL,换液2次后,再加入 1 mg/L转化生长因ß1 2 mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化。 主要观察指标：行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。 结果：骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因ß1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;II型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性。 结论：应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因ß1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

In vitro differentiation of bone marrow stromal cells into neurons and glial cells and differential protein expression in a two-compartment bone marrow stromal cell/neuron co-culture system

This study was performed to establish a bone marrow stromal cell (BMSC)/neuron two-compartment co-culture model in which differentiation of BMSCs into neurons could occur without direct contact between the two cell types, and to investigate protein expression changes during differentiation of this entirely BMSC-derived population. Cultured BMSCs isolated from Wistar rats were divided into three groups: BMSC culture, BMSC/neuron co-culture and BMSC/neuron two-compartment co-culture. Cells were examined for neuron-specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression. The electrophysiological behavior of the BMSCs was examined using patch clamping. Proteins that had significantly different expression levels in BMSCs cultured alone and co-cultured with neurons were studied using a protein chip–mass spectroscopy technique. Expression of NSE and GFAP were significantly higher in co-culture cells than in two-compartment co-culture cells, and significantly higher in both co-culture groups than in BMSCs cultured alone. Five proteins showed significant changes in expression during differentiation: TIP39_RAT and CALC_RAT underwent increases, and INSL6_RAT, PNOC_RAT and PCSK1_RAT underwent decreases in expression. We conclude that BMSCs can differentiate into neurons during both contact co-culture with neurons and two-compartment co-culture with neurons. The rate at which BMSCs differentiated into neurons was higher in contact co-culture than in non-contact co-culture.     

大鼠骨髓基质干细胞体外分离、培养及分化的相关实验研究

目的探索大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)体外分离、培养及纯化的合适实验条件,并探讨其在体外定向诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法通过密度梯度离心法从成年大鼠骨髓中分离出BMSC,而后通过贴壁培养法培养及纯化,观察其生长特性;对纯化后的BMSC使用碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)进行定向诱导分化,并进行免疫细胞化学鉴定。结果体外培养的BMSC传4代后,纯度最高,可达(95.23±3.06)%;其诱导分化7 d后,(75.43±7.63)%的细胞表现为-βTubulinⅢ阳性的神经元样细胞,(33.01±6.73)%的细胞则为GFAP阳性的胶质细胞。结论BMSC在体外培养条件下生长良好,经bFGF和EGF诱导后可大量分化为神经元样细胞和神经胶质细胞。     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景：在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚。 目的：课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成。 材料：人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意。健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供。 方法：从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组：pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组。转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染。 主要观察指标：使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况。 结果：转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性。pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P < 0.05或0.01)。 结论：实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力。     

重组质粒pcDNA3.1 his-hTH与pEGFP-C2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究

目的 构建携带人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)目的基因片段的真核表达重组质粒-pcDNA3．1his-hTH，与pEGFP-C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况。方法 应用基因重组技术，将pWAV2-TH中TH基因亚克隆到pcDNA3．1his真核表达载体，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3．1his-hTH的正确性；将pcDNA3．1his-hTH和pEGFP-C2经电击穿孔法共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，24h后观察EGFP瞬时表达情况，10d后进行hTH基因RT-PCR，以及hTH和6His单克隆抗体的免疫组化检测。结果 (1)酶切和测序结果均证实pcDNA3．1his-hTH的正确性；(2)细胞转染24h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，80％以上细胞发出绿色荧光；10d后RT-PCR检测到细胞内有hTH基因的表达，免疫组化结果显示细胞有hTH和6His抗原表达。结论 成功构建的pcDNA3．1．his-hTH和pEGFP-C2能够共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，hTH、EGFP和6His基因在细胞内有效表达。该系统可以作为体外检测转染率、细胞移植治疗帕金森病活体跟踪移植细胞的技术平台。     

趋化因子CXCL-16体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的 探讨趋化因子CXCL-16对骨髓基质细胞的体外迁移作用.方法 采用全骨髓法培养成年Wistar-大鼠骨髓基质细胞,取第5代骨髓基质细胞行流式细胞仪鉴定;然后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR6的情况,利用Transwell小室法探讨趋化因子CXCL-16对骨髓基质细胞的体外趋化作用及其特异性.结果 第5代骨髓基质细胞的间充质干细胞的标志CD29的表达呈阳性,而造血干细胞表面标志CD45呈阴性;细胞免疫荧光及RT-PCR结果从基因和蛋白两方面证实骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR6,趋化凶子CXCL-16(5～500 ng/ml)体外可趋化骨髓基质细胞迁移,抗CXCR6多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用.结论 CXCL-16/CXCR6通路参与骨髓基质细胞体外迁移,为进一步研究骨髓基质细胞的迁移机制提供了理论依据.     

人骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷

背景：目前已有将体外培养的骨髓基质细胞与支架复合修复骨缺损的临床报道。但是由于该类复合材料中缺乏骨生长因子作用，在原位的成骨作用并不十分理想。 目的：探讨携带人骨形态发生蛋白2基因的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷材料在修复兔颅骨缺损中的原位成骨作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-02/2008-11在辽宁医学院解剖学实验室完成。 材料：生物活性玻璃陶瓷由中国科学院四川成都光电研究所提供，转人骨形态发生蛋白2和转pcDNA3载体的骨髓间充质干细胞由辽宁医学院解剖学教研室骨组织工程研究所保存。 方法：制备兔双侧颅骨骨缺损模型，将基因转染的骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷复合培养物植入骨缺损区，术后第4,8,12周对植骨区进行大体观察、X射线摄片、组织切片、组织化学检测。 主要观察指标：①复苏后的转染人骨形态发生蛋白2的骨髓基质细胞的生长特性。②从大体、X射线结果和组织学等方面观察复合材料在原位修复骨缺损的作用。 结果：转染的骨髓基质细胞在细胞形态及增殖特性方面与未转染的细胞无明显差异。扫描电镜显示基因转染的骨髓基质细胞在生物活性玻璃陶瓷表面呈星形紧密排列，长入生物活性玻璃陶瓷孔隙中。复合材料植入免颅骨缺损后，X射线观察术后第4周骨缺损外周骨质与复合材料之间大部分被高密度阴影充填，术后第12周骨缺损外周骨质与复合材料之间完全被高密度阴影充填；光镜观察术后第8周骨小梁大部分相连成片，术后第12周骨小梁粗大，骨髓再生。 结论：基因转染的骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷材料基本符合骨组织工程学的要求，在骨缺损区原位具有良好的成骨作用。 关键词：骨髓基质细胞；基因转染；生物活性玻璃陶瓷；骨缺损     

In vitro differentiation of bone marrow stromal cells into oligodendrocyte-like cells using triiodothyronine as inducer

An in vitro technique was devised to induced autologous adult stem cells into oligodendrocyte-like cells. In this study, a protocol was developed for the induction of bone marrow stromal cells (BMSCs) into oligodendrocyte-like cells. BMSCs were incubated in one of these three pre-inducers: dimethyl sulfoxide (DMSO), β-mercaptoethanol (βME) or biotylated hydroxyanisol (BHA), each followed by retinoic acid (RA) treatment. The percentage of viable cells in BHA-RA preinduced cells was significantly lower than the others. The results showed that the preinduced cells were immunoreactive for nestin and NF-68; among the mentioned protocols, the immunoreactivity yielded by following the DMSO-RA protocol was significantly higher than the others. Moreover, no significant immunoreactivity was observed for preinduced cells to O4, O1, MBP (myelin basic protein), S100, and GFAP (glial fibrillary acidic protein). The cells were immunoreactive to oligo-2. Two phases of induction were done: the first was a combination of basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor (PDGF) and heregulin (HRG), followed by either triiodothyronine (T3) or Forskolin (FSK) as the second phase. The conclusion is that the trans-differentiation of BMSCs by DMSO followed by RA (preinduction stage) then bFGF-PDGF-HRG followed by T3 (10 ng/ml) (induction stage) can be a potential source for oligodendrocyte-like cells preparation.