SARS冠状病毒主要蛋白酶构象运动性分析

SARS冠状病毒3CL蛋白酶的单体结构由3个结构域构成,其中第1、2个结构域紧密堆积成糜胰蛋白酶折叠类型,第3个结构域由5个α螺旋构成,较为独立.有实验证明3CL蛋白酶的α螺旋结构域的缺失会影响酶的催化活性.另外3CL蛋白酶还有可能具有RNA结合功能.因此研究α螺旋结构域的作用有助于认识SARS冠状病毒3CL蛋白酶的生物功能.我们对于SARS冠状病毒 3CL蛋白酶的单体分子进行了分子动力学模拟,采取全原子模型,加入溶剂水分子,进行了3 次1 ns的模拟.同时我们还利用弹性网络模型对于SARS冠状病毒3CL蛋白酶进行了正则振动分析.分子动力学模拟及正则振动分析表明α螺旋结构域相对于糜胰蛋白酶结构部份有整体的大运动,在两个垂直的方向上有方向相反的振动模式(图1).原子热运动分析表明酶催化活性附近的两个表面环区有较大的构象运动性.     

SARS冠状病毒推定结构蛋白序列分析

2003年4月16日WHO正式宣布,蔓延全球的严重急性呼吸综合征 (Severe Acute Respiratory Syndrome ,SARS)的病原体是一类新的未知冠状病毒.并命名为SARS冠状病毒(SARS coronav irus, SARS CoV).     

2株SARS相关冠状病毒主要结构蛋白基因的多态性分析

目的:分析2株SARS相关冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus,SARS-CoV)HK21378和BJi04的主要结构蛋白基因序列的多态性以及蛋白质结构变化与功能的关系.方法:提取组织培养物中的SARS-CoV基因组RNA,对RT-PCR产物进行测序;以GZ02为参照序列,对蛋白质编码序列进行基因多态性分析和蛋白质结构与功能关系分析.结果:①与SARS-CoV GZ02株相比较,HK21378和BJi04主要结构蛋白编码序列共有14个变异位点,其中9个变异位点为两者共有,3个变异位点见于HK21378,2个变异位点见于BJ104;与GenBank数据库已发表的103株SARS-CoV基因组数据比较,变异位点22901(T→G)为BJ104特有,未见于已发表的其他SARS-CoV基因组中;在14个多态位点中,有5个多态位点为同义突变,其余9个为非同义突变.②14个变异位点中有11个变异发生在S蛋白编码区,其碱基变异频率为3.7/kb;2个见于M蛋白编码区,其碱基变异频率为3.0/kb;1个见于N蛋白编码区,碱基变异频率为0.8/kb;而E蛋白编码区未见变异位点.结论:SARS-CoV的主要结构蛋白编码区容易发生变异,尤其是膜表面S蛋白和M蛋白编码区.     

SARS相关冠状病毒的基因组和主要蛋白酶的研究进展

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)在2003年我国南方暴发流行,波及众多国家和地区,引起了全球关注.在SARS 病原体被确证为一类新的冠状病毒并被命名为SARS coronavirus(SARS-CoV)之后,全球对SARS相关冠状病毒进行了广泛的研究.至目前,SARS-CoV的基因组已在多个实验室被测定,并通过多种途径分析了其基因结构特征,研究了基因复制与翻译中相关的蛋白酶特性.SARS-CoV具有复杂的基因复制和翻译调节机制,如sg mRNA的不连续转录、核糖体的框移、翻译后的水解过程等等.其中SARS-CoV的3种蛋白酶(解旋酶和另外2种半胱氨酸蛋白酶)在病毒的复制、转录、翻译和翻译后加工等过程中发挥重要的生理和病理作用.本文综述了SARS-CoV的基因组成和主要蛋白酶的结构及其功能等方面的研究进展.     

Bcl-2蛋白与Bak蛋白肽片段复合物的三维结构模建与分析

目的:探讨抗肿瘤药物新靶点Bcl-2蛋白与底物蛋白的相互作用.方法:以同源模建的方法构建Bcl-2蛋白与底物Bak蛋白的肽片段的复合物的三维结构,并对此结构模型的合理性进行验证.比较复合物结构模型中Bcl-2的活性腔与自由状态结构的差异,分析它与底物肽相互作用的重要位点和残基,并计算它与两类抑制剂的分子对接.结果:构建的Bcl-2复合物结构模型合理,通过比较发现模建的结构模型中活性腔特别是α3前后的部位与自由状态有较大的结构变化,蛋白活性腔侧部的一些酸性碱性极性残基及底部的一些疏水残基对于结合底物蛋白并发挥功能非常关键,这些结果与生物学残基突变实验数据得到了较好的相互验证.结论:本研究构建了合理的Bcl-2蛋白与底物Bak蛋白肽片段的复合物的三维结构.     

SARS冠状病毒Orf3和Orf4的克隆和分析

目的:克隆SARS冠状病毒的Orf3和Orf4两个开放性读框,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析.方法:通过RT-PCR,从SARS冠状病毒基因组中扩增得到特异性片段,利用TA克隆将PCR产物克隆入PUCm-T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析.结果:RT-PCR扩增出的特异产物与预期长度相符,序列分析表明,其核苷酸序列与已发表的SARS病毒的Orf3和Orf4同源性在99%以上.结论:成功克隆SARS冠状病毒Orf3和Orf4两个开放性读框,为表达及功能研究奠定了基础.     

SARS 冠状病毒全基因组突变初步分析

截至 2 0 0 3年 5月 12日 ,世界各地向GenBank已经提交了 12条SARS冠状病毒的全基因组序列 (新加坡 5条、香港3条 ,北京 1条 ,美国 1条 ,加拿大 1条 ,台湾 1条 )。我们收集了相关的数据 ,并对这 12条序列 (表 1)做了比对分析 ,试图考察SARS冠状病毒自SARS流行以来有无大规模的转型 ,是否出现比较有意义的突变。表 1　SARS基因组序列Table 1　GenomesequenceofSARScoronavirusSequenceName AccessionNoPlaceSARScoronavirusTW 1AY2 914 5 1TaiwanSARScoronavirusCUHK W 1AY2 785 5 4HongKongSARScoronavirusisolateSI…     

SARS冠状病毒RNA聚合酶编码区分析

SARS冠状病毒(SARS coronavirus ,SARS CoV)和同家族的其他冠状病毒一样,是一类单链的正义RNA病毒 ( single-stranded, (+)sense RNA virus).与其他种类的病毒(如负义RNA 病毒)相比,这类病毒有两个最重要的特征:(1)在其成熟的病毒颗粒中并没有RNA聚合酶(viral RNA polymerase)存在,即病毒复制、转录所需的病毒特有的RNA聚合酶,是在侵入宿主细胞之后才合成的. 而且,只是在病毒的扩增阶段,保留在宿主细胞内行使功能,并不参与病毒颗粒的组装.     

非SARS患儿体内SARS冠状病毒抗体的检测分析

目的探讨非急性重症呼吸综合征(SARS)患儿体内是否存有SARS冠状病毒相关抗体。方法采用国家药品生物制品检定所正式检定通过的2种SARS抗体诊断试剂(间接免疫荧光检测试剂和双抗原夹心ELISA试剂),对广州地区1 060例非SARS患儿血清样本进行检测。结果1 060例非SARS患儿血清样本,间接免疫荧光法检测IgM、IgG均为阴性。双抗原夹心ELISA法检测也仅有2例出现弱阳性。结论非SARS患儿体内并未存在SARS病毒相关抗体。     

SARS冠状病毒可能编码蛋白质的三级结构预测

在本研究组稍早的工作中[1],我们已经基于基因组序列和蛋白质初步分析,完成了SARS冠状病毒(SARS Coronavirus, SARS CoV)所有推测蛋白质(putative protein)的二级结构分析 .     

SARS患者血清中SARS相关冠状病毒抗体产生规律的初步分析

目的 :了解严重急性呼吸综合征 (SARS)患者血清中 SARS病毒特异性 Ig M、Ig G抗体产生的规律。方法 :随机选取32例 SARS患者 5 5份血清标本 ,应用 EL ISA分别检测抗 SARS病毒 Ig M、Ig G抗体。结果 :Ig M抗体阳性率为 5 6 .4 % ,平均出现时间为 (5 .88± 2 .6 2 ) d,其中 2例患者在发病后第 2天即出现阳性 ,平均消失时间为 (14 .2 5± 2 .97) d;Ig G抗体阳性率为4 1.9% ,平均出现时间为 (11.4 0± 4 .2 0 ) d,其中 2例患者在发病后第 3天即为阳性 ;Ig M和 Ig G抗体的总体阳性漏检率为6 .2 5 %。结论 :SARS患者于发病后 3～ 7d血清中出现特异的 Ig M抗体 ,可用于实验室诊断 ;同时进行 Ig M和 Ig G抗体的检测可用于发病 8～ 14 d左右的实验室排查检测     

SARS病毒膜融合抑制剂的鉴定

目的：用分子对接技术预测HIV融合抑制剂是否能对SAILS起作用。方法：搜寻HIVsp41融合抑制剂,用DOCK软件分析其与SAILS蛋白的S2结构域HRl三聚体晶体结构的亲和力。结果：预测了23个小分子。ADS-J1、ADS-J2、XTYFormazan等几个小分子得分较高,提示与S2结构域有亲和力。结论：发现抗HIV的融合抑制剂有可能对SARS起作用。     

Expression and Purification of SARS Coronavirus Membrane Protein

To construct a recombinant plasmid Pet23a-M, the gene encoding severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus membrane protein was amplified by RT-PCR and cloned into the expression plasmid Pet23a. Results of restriction endonuclease analysis, PCR detection and DNA sequencing analysis revealed that the cloned DNA sequence was the same as that reported. The recombinants were transformed into Escherichia coli (E. Coli) BL21 (DE3) and induced by Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression of 27 kD (1 kD=0. 992 1 ku) protein was detected by SDS-PAGE and pured by metal chelated chromatography. Results of Western-blot showed that this expressed protein could react with antibodies in sera of SARS patients during convalescence. This provided the basis for the further study on SARS virus vaccine and diagnostic agents.     

SARS患者血清冠状病毒抗体检测

目的探讨SARS患者血清冠状病毒抗体产生情况.方法采用ELISA方法,对42例临床诊断SARS患者、47例普通肺炎患者和30例正常人进行血清冠状病毒抗体(IgG,IgM)检测.结果42例临床诊断为SARS患者,36例可在10 d左右检测到IgM抗体,阳性率为85.7%,IgG抗体阳性33例,阳性率为78.6%.47例临床诊断为普通肺炎的患者,IgM阳性2例,阳性率为4.26%,IgG阳性4例,阳性率为8.51%.30例正常人体检者没有出现IgM或IgG阳性.结论SARS冠状病毒抗体检测对临床早期诊断有一定的帮助.     

SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA，构建原核表达质粒pGEX-5T／S1，并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段，并克隆入载体中，经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点，转化大肠杆菌K802，将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达，纯化后的蛋白用ELISA法检测，结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1，为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白S1区多肽与SARS病人血清的免疫反应

目的 测定根据计算机预测的SARS冠状病毒S蛋白S1区的抗原表位多肽与SARS病人血清的免疫反应,以寻找和确定SARS相关冠状病毒的中和抗原表位。方法 采用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白S1区的多肽,并用ELISA方法检测合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应。结果 合成的8个多肽与SARS病人血清免疫反应的光密度值是其与正常人血清免疫反应的光密度值的1.5～2.6倍。结论 合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应较低,提示这些多肽是否为SARS冠状病毒的抗原表位还要进一步研究。     

重组SARS-CoV刺突蛋白基因片段的原核表达及纯化

目的:冠状病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是病毒的主要结构蛋白之一,也是重要的病毒抗原,重组S蛋白的表达可用于检测病毒感染后血清抗体.方法:根据抗原性预测分析结果,将S蛋白中抗原决定簇的编码基因重新拼接成两个新的基因,通过全基因合成方式直接合成至原核表达载体pET32a( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni-NTA试剂盒纯化目的蛋白.结果:SDS-PAGE证实重组S蛋白的表达,并被纯化.结论:重组刺突蛋白的表达及纯化,可做为检测SARS-CoV抗体的抗原,有助于进一步开展SARS-CoV相关研究.