鹅常见病毒性疾病的快速诊断技术的建立及其应用

根据3种病原基因组相关基因的序列特征设计了三对PCR引物，用于鹅常见的病毒性疾病包括鹅副粘病毒病、鸭瘟、小鹅瘟的鉴别诊断．三对引物均能从各自的参考毒株扩增出与预计片段大小一致的产物，而对其它的病原的扩增结果均为阴性；应用建立的PCR方法对来自广西不同地方的38份临床可疑病例分别进行诊断，DPV、APMV-1和GPV的检测阳性率分别为66．6％(10／15)、55．6％(15／27)和75％(6／8)，二重及三重混合感染的占42．8％(9／21)．研究结果表明建立的PCR方法具有快速、敏感、特异的特点，可用于疫病的临床快速鉴别诊断特别是多重感染的诊断以及流行病学的调查研究．     

检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立及初步应用

鹅细小病毒(GPV)是一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的病原,给养禽业带来了巨大的经济损失.利用GPV的VP3基因保守区域设计了一对引物和探针,经反应体系的优化,建立检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法(ii PCR方法),并与TaqMan荧光定量PCR方法比较.结果显示,该方法能特异性检出GPV,对其他常见无关病原不检出,特异性好;检测下限是38.1拷贝·μL^-1,灵敏度高;批内、批间变异系数均小于5%,重复性好;该方法对31份临床疑似样本的检出率为93.54%,高于TaqMan荧光定量PCR方法的检出率(83.87%).本研究为鹅细小病毒的现场快速检测提供了新的技术手段.     

鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析。结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%~99.8%,氨基酸同源性为96.5%~99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。     

鹅细小病毒C日v强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对擂人片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV,M DPV,PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析.结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码 534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%-99.8%,氨基酸同源性为96.5%99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础.与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远.     

白斑综合征病毒(WSSV)和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp(WSSV)和168 bp(血卵涡鞕虫),与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

实验动物雪貂阿留申病病毒核酸检测方法的建立

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。     

李坏死环斑病毒检测方法的比较研究

针对感染李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）植株病毒的特异性检测,将DAS—ELISA、RT—PCR方法综合改进、优化,建立了免疫捕获反转录PCR（IC—RT—PCR）检测PNRSV的方法．该方法采用PNRSV抗体特异性免疫捕获病毒,并根据GenBank中PNRSV序列设计的特异性引物对PNS／PN3进行PCR扩增,得到约760bp大小的特异性基因片段．扩增产物经克隆测序后,结果表明：产物序列与PNRSV的外壳蛋白编码基因存在94％～98％的同源性．检测广泛性以及灵敏度比较研究显示,IC—RT—PCR方法能从含量很低的受病样品中检出PNRSV,检测灵敏度与RT—PCR相近,但所检测样品的范围更广,适用于从植物各部位检测低含量的病毒．IC—RT—PCR检测灵敏度比DAS—ELISA方法高出1000倍．     

传染性法氏囊病快速诊断技术的建立及其应用

根据已发表的IBDV各致病型毒株的序列，在病毒结构蛋白VP2编码基因的高变区(VP2 variable domain,vVP2)两端外侧的保守序列内设计合成了2条寡核苷酸引物，对各种不同致病型的12株参考毒株进行逆转录酶一聚合酶链式反应(RT—PCR)的检测．结果 12个参考毒株均能扩增出约679 bp的目的片段，而对作为阴性对照的常见5种鸡病病原NDV、IBV、CAIV、E．coli、pM均没有扩增出任何片段；应用建立的技术对疑似IBD的34份临床病料进行检测，并同时在基础RT—PCR扩增的片段内设计另一对引物进行Nested—PCR检测．结果基础RT—PCR方法检测到ll份阳性，Nested-PCR检测到23份阳性．研究的结果表明建立的IBD的RT—PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点．在此基础上设计的Nested—PCR则大大提高了阳性检出率(提高52．1％)．     

应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒

为了简化聚链反应（PCR）程序和加快检测速度,将二温式PCR与多重PCR结合起来,建立一种同是检测鸡传染性支气管炎病毒（IBV）和鸡传染性喉气炎病毒（ILTV）的二温式重PCR技术,试验根据IBV和ILTV的基因文库,设计2对分别与IBV和ILTV某段基因序列互补的引物。用这2对引物同一样品中的IBV、ILTV核酸模板进行二温式多重PCR扩增,结果均同时得到2条特异性大小与实验设计相符的1720bp(IBV)和647bp(ILTV）的扩增带,而对其他6种禽病病原的扩增结果均为阴性,敏感性测定结果表明明,该二温式多重PCR技术检出10pg的IBV RNA模板和10pg的ILTV DNA模板。     

多重PCR检测病死鸡中沙门氏菌方法的研究

为了建立能够同时检测病死鸡样品中的沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的多重PCR 方法.采用煮沸法提取 DNA 做为模板,选择分别针对沙门氏菌属、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的特异性基因(invA、fliC、sdfⅠ)设计引物,优化反应体系和反应参数,建立多重PCR检测方法.应用该方法对国内17家鸡场369份病死鸡样品进行沙门氏菌的检测,检测结果与传统细菌培养法的结果进行比较.结果表明,优化过的多重 PCR 可同时对沙门氏菌种、属进行鉴定,灵敏度为4.6×102 CFU/mL;多重 PCR 方法共检测出沙门氏菌34株,其中鸡白痢沙门氏菌21株、肠炎沙门氏菌5株,与传统细菌培养法检测结果的符合率分别为91.2%、90.5%和80.0%.     

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型症状的病犬肠溶物经ＳＤＳ－酚裂解法提取总ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,通过人工合成的两条２０ｍｅｒ引物进行ＰＣＲ扩增,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白ＶＰ２基因中间１／３区段,ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳,试验结果表明：用ＰＣＲ扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性,应用该方法检测的２７份病犬肠溶物样品块获得了预计长度的ＤＮＡ片段（５３１ｂｐ）,而健康犬的肠溶物样品ＰＣＲ结果为     

多重RT-PCR方法对人肺炎链球菌菌种、血清型及耐药性的鉴别检测

首先,选择肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)基因LytA、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)基因P1、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP)基因ompA作为目标检测靶点设计引物探针,建立鉴别肺炎链球菌菌种的多重RT-PCR方法.其次,针对肺炎链球菌cps基因座序列,利用MGB-TaqMan探针的多重RT-PCR方法对肺炎链球菌的血清型进行鉴别检测.最后,针对肺炎链球菌耐药基因ermB、mefA为靶标设计引物探针,采用多重RT-PCR方法对其临床阳性样本的耐药性进行鉴别检测.肺炎链球菌鉴别检测多重RT-PCR方法,线性范围为102~107 copies/mL,R2分别为0.999、0.996和0.995,灵敏度可达102copies/mL,与其他病原体无交叉反应.512例临床样本经多重RT-PCR方法鉴别检测,肺炎链球菌189例(189/304,62.17%),肺炎支原体83例(83/304,27.30%),肺炎衣原体32例(32/304,10.53%),与单重FQ-PCR及基因测序法比较无统计学差异(P0.05).189例肺炎链球菌临床样本,经多重RT-PCR检测,血清分型为:19(19.58%,37/189)、23(15.87%,30/189)、6(13.23%,25/189)、14(6.3%,12/189),其他血清型(22.75%,43/189),其他血清型(22.22%,42/189).肺炎链球菌抗药菌株突变检测为:ermB突变115例(115/189,60.85%),mefA突变56例(56/189,29.63%),两基因共突变15例(15/189,7.94%).     

吐鲁番温室番茄病株及传毒烟粉虱的双生病毒检测与鉴定

为了明确吐鲁番地区温室番茄黄化曲叶病的病毒种类及传毒烟粉虱的生物型及携带病毒的情况,本研究利用番茄黄化曲叶病毒的特异引物通过PCR检测和DNA测序,对温室采集的43个番茄病株进行了病毒种类的分子鉴定;利用烟粉虱特异引物和番茄黄化曲叶病毒特异性引物通过PCR检测和DNA测序,对鄯善县温室采集的180头烟粉虱进行了生物型鉴定和带毒检测,并构建了双重PCR检测方法。结果显示:吐鲁番市和鄯善县温室发生的番茄黄化曲叶病的病毒种类为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),病株带毒率为39.5%。鄯善县温室发生的烟粉虱主要为Q型烟粉虱,带毒率为67.8%,是主要的传毒介体。本研究建立的双重PCR检测技术,能快速有效地确定Q型烟粉虱的生物型和携带TYLCV的情况。     

猪多杀性巴氏杆菌(PM)PCR诊断技术的建立

参照文献报道的猪多杀性巴氏杆菌（PM）基因组的部分序列,设计合成引物,建立了PM的PCR诊断技术,并对各反应条件进行优化.本实验建立的PM的PCR扩增片段大小为457 bp.以建立的PCR方法对临床送检的可疑病猪的肺部病料进行了特异性检测和敏感性试验及生化鉴定.结果表明PCR检测阳性结果与猪多杀性巴氏杆菌的形态染色、培养特性和生化鉴定结果一致,该PCR方法在临床诊断中具有应用价值.     

支原体种属特异性PCR引物的设计及对细胞培养物支原体的检测

目的快速全面检测感染细胞、疫苗等多种生物制品中的支原体.方法从多种支原体的16SrRNA核酸序列中选择了两段高度保守的核酸序列,作为支原体种属特异性引物,对标本进行检测.结果用这对种属特异性引物对已知阳性的50份标本进行检测,检测结果显示全部为阳性.应用于实践,检测了89份疫苗标本,阳性率为31.4%,而用常规培养法检测阳性率为12.3%.结论用该种属特异性引物检测支原体具有检测速度快、检测灵敏度高、特异性强等优点.     

LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因

Halobacterium species xz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌，所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视．连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法．LPA法利用“酶切-连接-PCR”之组合，首先选定一组限制性内切酶，各自单独地酶切细菌总DNA样品，然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接．连接液混合起来，作为扩增未知序列DNA的模板．通过这种方法，克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0．4kb上游调控区域的总长度1．3kb的DNA片段．实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法，可以快速有效地获得目标基因相关的序列．     

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。