bFGF对新生大鼠内耳听觉细胞的增殖和分化的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养的听觉感觉上皮细胞增殖和分化的影响?方法:取新生大鼠听觉上皮细胞进行体外培养,用BrdU和calretinin染色,以观察bFGF对细胞增殖和分化的影响?结果:①100?200 ng/ml bFGF组中的BrdU阳性着染的细胞分别占所观察细胞的36%和35%,与对照组相比有显著差异;而1?10 ng/ml bFGF组中的有丝分裂活动很微弱,分别为3%和7%?②100?200 ng/ml bFGF二组中calretinin阳性着染的细胞数量分别占所观察的细胞总数的7%和7.6%,1?10 ng/ml bFGF组中,calretinin阳性着染的细胞数量分别为0.5%和1.6%?结论:耳蜗上皮细胞的增殖活动和向毛细胞方向的分化受生长因子的调控,bFGF有较强的促增殖和促早期分化的作用?     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

牙源性角化囊性瘤上皮细胞的体外培养及鉴定

目的:建立牙源性角化囊性瘤上皮细胞体外培养体系并进行初步鉴定.方法:采用组织块及酶消化法原代培养牙源性角化囊性瘤上皮细胞,以无血清的角化上皮细胞培养基进行体外连续培养,并行细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定.结果:体外培养的牙源性角化囊性瘤上皮细胞为多角形,胞浆均匀,轮廓清晰,表现上皮细胞特有的铺路石样外观,体外可传2～4代,生长周期约30～50 d.经波形丝蛋白、广谱角蛋白及角蛋白10、角蛋白14免疫组化染色证实,分离培养的细胞为上皮来源,无间充质细胞混杂.结论:采用无血清的角化细胞培养基可在体外进行牙源性角化囊性瘤上皮细胞的连续培养.     

体外构建气管黏膜上皮组织的研究

目的:应用组织工程原理和方法在体外构建气管黏膜上皮组织.方法:将原代兔气管上皮细胞种植在铺有鼠尾胶原的小肠黏膜下层(SIS)上培养,在体外构建气管黏膜上皮组织,培养1 wk后行HE染色,对气管上皮细胞行免疫细胞学鉴定.结果:原代气管上皮细胞培养1 wk后增殖旺盛,10 d时上皮细胞分布范围更广. 将构建的气管黏膜上皮组织行HE染色,显示有气管黏膜上皮和SIS双层结构. 抗角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学反应阳性显色率可达90%左右.结论:将铺有鼠尾胶原的SIS复合气管上皮细胞生长,成功的在体外构建出组织工程化的气管黏膜上皮组织.     

体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性

目的 探讨体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性,为构建组织工程尿道提供种子细胞.方法 取尿道下裂患者尿道黏膜,经消化离心后,接种于培养基中连续培养,观察细胞形态变化及生长、增殖过程,并绘制生长曲线;对细胞进行常规冻存和复苏;应用免疫细胞化学技术进行角蛋白染色的鉴定.结论 体外培养的细胞呈铺路石样外观,可传至8代;可进行常规冻存和复苏;角蛋白免疫细胞化学染色呈阳性.结论人尿道黏膜上皮细胞的体外连续培养及扩增技术被建立,本实验培养的细胞可用于构建组织工程尿道.     

不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的比较研究

目的比较不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的效率，确定体外培养兔结膜上皮细胞的最佳方法，建立兔结膜上皮细胞系，为进一步研究结膜上皮干细胞的鉴别、定位及其增殖分化提供基础。方法分别采用DispaseⅡ消化法、组织块培养法、胰酶／EDTA混合消化法获得兔结膜上皮细胞后进行体外培养，在不同时间观察细胞的形态，并应用免疫组化的方法进行细胞鉴定。结果组织块培养法细胞生长较慢，胰酶／EDTA混合消化法容易有成纤维细胞等污染，DispaseⅡ化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞，细胞生长增殖快，免疫荧光pan-cytoeratin染色阳性．部分细胞MUC5AC染色阳性。结论DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的最佳方法。     

人GLP-1(7-36)酰胺促进非肥胖型糖尿病小鼠胰腺导管上皮细胞分化

目的 探讨人胰高糖素样肽1(GLP-1)对非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠胰腺导管上皮细胞分化与增殖的影响.方法 GLP-1治疗组小鼠用微型渗透泵皮下持续泵入人GLP-1,对照组小鼠泵入生理盐水,4周后将其胰腺组织分别做导管细胞角蛋白(DCK)/胰岛素双重免疫荧光染色、胰腺十二指肠同源异型盒基因(PDX-1)/胰岛素双重免疫荧光染色及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)/DCK双重免疫染色,显微镜下观察胰腺导管上皮细胞的分化和增殖.结果 在GLP-1治疗组胰腺导管上皮中可见较多胰岛素阳性细胞及PDX-1/胰岛素双阳性细胞,而在对照组几乎看不到;GLP-1治疗组小鼠BrdU阳性的导管上皮细胞的百分数与对照组小鼠相比明显增高(P ＜0.001).结论 人GLP-1持续刺激NOD小鼠后,可促进胰腺导管上皮细胞分化与增殖.     

人视网膜色素上皮细胞的培养

目的 :培养人视网膜色素上皮细胞 ,为采用视网膜色素上皮移植治疗色素变性奠定基础。方法 :用胰酶消化法获取人胎儿视网膜色素上皮细胞进行原代及传代培养。角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果 :视网膜色素上皮细胞在体外生长良好 ,胞浆内含有丰富的色素颗粒。抗角蛋白反应阳性。结论 :体外培养视网膜色素上皮细胞成功为细胞移植提供了一个良好的来源     

哺乳动物初级精母细胞体外培养的研究

目的:探讨哺乳动物初级精母细胞体外培养分化的可能性.方法:制备雄性大鼠睾丸初级精母细胞,与非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)共培养,观察初级精母细胞体外培养过程中的生长行为,用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记跟踪观察大鼠初级精母细胞在体外培养中的分化情况.结果:大鼠初级精母细胞与Vero细胞共培养后能进行减数分裂阶段分化,生成精子细胞;BrdU标记检测结果显示,培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞,培养后在有BrdU标记的细胞中有早期精子细胞.结论:哺乳动物初级精母细胞在体外培养中能进行分化.     

神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的探索神经膜（旧称许旺细胞）与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法用10μmol／ml BrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人T神经桥接体，移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋门免疫组化染色鉴定许旺细胞，倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养．石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长，移植入神经缺损处4周后，坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解．黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养．构建成人工神经桥接体．填补神经缺损。     

兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究

 【目的】观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。【方法】24只新西兰兔随机分为2组。实验组：培养有人MSCs的羊膜移植组，将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔眼表结膜缺损区；对照组，单纯羊膜移植组。分别于移植后1，2，3，4，6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3／12（CK3／CKl2）和角蛋白13（CK13）的表达。【结果】MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区，术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。【结论】人羊膜可作为MSCs的载体，采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植，MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖。     

LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞的扩增与诱导分化

目的构建LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞的扩增与诱导分化技术平台,为进行体内移植携带报告基因的神经干细胞研究奠定基础.方法利用无血清培养基,分离并体外培养LaZ转基因胚胎小鼠腹侧中脑神经干细胞,连续稳定传代20代后,以免疫荧光、免疫细胞化学法及组织化学方法检测神经球Nestin和分化后细胞中神经纤维（NF）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、Galc和半乳糖苷酶（X-Gal）的表达.结果从LaZ转基因小鼠腹侧中脑分离的细胞群具有连续形成神经球的能力,其Nestin表达阳性.分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原.所有细胞半乳糖苷酶组织化学均为阳性.结论LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞可稳定扩增,具有多向分化潜能,分化后细胞携带LaZ报告基因,可用于进一步的移植实验研究.     

小鼠皮肤干细胞染色体非随机分配方式的研究

目的：以小鼠皮肤干细胞为研究对象,对无论干细胞分裂多少次的一组DNA“永生化”链,能持续存在于干细胞基因组中的这一假说进行验证。方法：利用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入法,检测发育期和成年期标记的小鼠皮肤BrdU阳性细胞存在情况。结果：免疫组化结果表明,BrdU标记停止后24h,发育期和成年期标记的小鼠皮肤上皮细胞均为阳性,阳性部位为细胞核,7天后仍为阳性。90天后发育期小鼠皮肤上皮细胞中仍有少数阳性细胞,它们主要存在于毛囊的隆突部位,另有少数阳性细胞散落在基底层。但成年期小鼠30天后皮肤BrdU阳性上皮细胞已全部转为阴性。结论：本实验结果证实,小鼠皮肤干细胞中存在DNA永生化链,其染色体发生了非随机分配。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究

目的：拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：密度梯度离心和贴壁培养相结合,台盼蓝染色观察离心后细胞活性,绘制BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。诱导传代细胞向成软骨细胞分化,2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达和阿尔新蓝染色检测蛋白多糖的表达。BrdU标记BMSCs,观察最佳标记率及标记时间,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。结果：密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的BMSCs,分离后细胞活性均大于99%,BMSCs表面标记CD90、CD45、CD34阳性细胞表达分别为99.24%、0.03%、1.37%,BMSCs的生长曲线呈S形。成软骨诱导2周后Ⅱ型胶原免疫组化阳性,阿尔新蓝染色细胞基质被蓝染。BrdU标记后,MSCs标记率〉95%,BrdU细胞标记最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L,标记后细胞活性高。结论：采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高BMSCs;BrdU是一种简单、有效的标记BMSCs的方法,BrdU对细胞标记率高。     

大鼠骨髓间质干细胞的BrdU体外标记和体内示踪研究

目的探讨骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外标记和体内示踪技术。方法分离培养并鉴定大鼠BMSCs,进行5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后,体外培养被标记的BMSCs,观察其连续传代后的BrdU可标记时间和标记效率;建立大鼠胃黏膜损伤模型,将分离纯化的BrdU标记BMSCs移植到损伤的胃黏膜下,体内观察BrdU对活体移植BMSCs的示踪作用。结果免疫组化显示体外培养大鼠BMSCs的CD44、CD90表达阳性,CD14、CD45表达阴性,显微结构表现出干细胞特征。进行BrdU标记后,标记阳性率随标记时间延长而增高,48h达高峰,72h仍维持高阳性率。终浓度为10μmol/L的BrdU孵育48h、72h阳性标记率高于5μmol/L BrdU组(P<0.05),但与15μmol/L BrdU组阳性标记率差异无统计学意义(P>0.05),并且连续传代培养21d后也可检测到。BrdU可示踪BMSCs在损伤的胃黏膜下局部定植。结论 BrdU在浓度为10μmol/L、标记时间48h至72h标记效率较高;BrdU标记可用于一定时间段内BMSCs移植入体内后定植和生长的动态示踪观察方法。     

BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨连续培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)最佳标记时间、剂量。方法 差速贴壁法对SD鼠MSCs进行体外传代培养;第6代细胞行流式细胞仪鉴定细胞的表面抗原;以终浓度分别为5、10、15μmol/L的BrdU检测最佳标记剂量;在细胞生长融合前72、48、36、24、12、3h加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,并分别孵育至细胞融合,测定BrdU的标记率,找出最佳标记时间;免疫组化分析BrdU标记率。结果 流式细胞仪检测所标记的细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,并且连续传5代均可检测到。结论 传代后贴壁生长的梭形细胞为MSCs,终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,且可以连续检测到,提示BrdU标记可用于MSCs移植入体内后存活、生长和分化的动态观察。     

成鼠神经干细胞的分离、克隆和增殖

目的：从成年大鼠前脑室下带（SVZ)中分离神经干细胞,证实其增殖潜能和胚胎源性。方法：利用无血清培养和单细胞克降技术,在成年大鼠SVZ中分离出具有多潜能的神经干细胞。在单个细胞克实验中,将培养板分为两组：第1组采用纯新鲜培养液,第2组为新鲜与原代培养液各半的混合液。选取单个细胞克隆连续传代获得大量来源于同一细胞 的亚细胞系克隆。用5－溴－2－脱氧尿苷（BrdU）标记和免疫荧光检测证实其增殖潜能,并用免疫荧光技术检测神经上皮干细胞蛋白（Nestin)抗原的表达以证实其胚胎源性。结果：原代培养1周后每瓶细胞培养液中可见形成这些克隆细胞可连续传代。BrdU标记、免疫荧光检测及Nestin免疫荧光标记均获得阳性结果。结论：采用新鲜和原代培养各半混合的方法可提高神经干细胞单克隆形成率,且本实验中分离培养的神经干细胞具有增殖潜能和胚胎源性。我们的研究结果为下一步神经干细胞的分化研究奠定了基础。     

DNA永生化链和肿瘤干细胞关系的初步研究

目的:探讨DNA永生化链的分配方式与肿瘤干细胞之间的关系.方法:采用启动和促进两阶段化学诱癌方法在小鼠背部诱导皮肤肿瘤;用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测DNA永生化链在发育期、成年期小鼠皮肤成体干细胞及皮肤肿瘤干细胞中的滞留时间;图像分析DNA含量方法检测肿瘤细胞倍体变化.结果:诱癌4mo后,40只小鼠中有17只背部分别长出1～3个皮肤肿瘤.BrdU阳性细胞变化情况检测显示,24h后发育期、成年期标记的小鼠皮肤上皮细胞和肿瘤组织的细胞均为阳性,阳性部位为细胞核;60d后发育期标记的小鼠皮肤上皮中仍有少数细胞为阳性,它们主要存在于毛囊的隆突部位(bulge),少数位于皮肤基底层.标记后30d检测成年期标记的小鼠皮肤上皮细胞,结果均为阴性.标记后30d检测肿瘤组织发现仍有少数细胞BrdU阳性,这些肿瘤细胞主要分布在肿瘤实质组织和间质组织的交界部位;标记后60d检测,肿瘤组织中不再有BrdU阳性细胞.图像分析DNA含量方法发现上述17例小鼠肿瘤都是非整倍体核型.结论:小鼠皮肤成体干细胞存在DNA永生化链,其在有丝分裂过程中发生非随机分配,肿瘤干细胞中可能存在DNA永生化链,其分配方式趋向随机分配.