德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的非融合表达

目的在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶,为构建能高效表达β-半乳糖苷酶的食品级益生菌株奠定基础。方法选择德氏乳杆菌保加利亚亚种(1.1480和wch9901)β-半乳糖苷酶基因(lacZ)起始密码ATG上游-18bp到ATG下游1bp的一段包含SD位点和ATGA位点的序列为上游引物,PCR扩增lacZ,插入表达质粒pMG36e构建重组表达质粒。转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,提取重组质粒进行酶切鉴定和测序,并测定转化菌β-半乳糖苷酶活性。结果重组质粒酶切鉴定合格;其中插入的外源片段序列与德氏乳杆菌保加利亚亚种lacZ标准序列符合率达99%以上;携带重组质粒pMG36e-lacZ1.1480的大肠杆菌DH5α酶活性为3.074U/mL,酶比活性为6.939U/mgpro;携带重组质粒pMG36e-lacZwch9901的大肠杆菌DH5α酶活性为4.755U/mL,酶比活性为8.537U/mgpro。结论成功在大肠杆菌中非融合表达了德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶;本研究选择的SD位点和ATGA位点能在大肠杆菌中有效地引导蛋白的非融合表达。     

嗜酸乳杆菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达

目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ,为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并构建表达载体pET22b—lacZ-H、pQE31-H-lacZ和pQE31-lacZ,然后在大肠杆菌中诱导表达,并测定表达产物的β-半乳糖苷酶活性。结果无标签的重组嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达,表达量可达2．28kU／L．而融合His-Tag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β-半乳糖苷酶活性,即使复性也不能恢复。结论克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。     

产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株的筛选、鉴定及酶特性研究

目的 筛选新的产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株,为解决目前工业用β-半乳糖苷酶耗能大、pH要求高的难题创造条件.方法 通过含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的筛选培养基在油田附近土壤中分离纯化菌株并进行鉴定,以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物测定酶特性.结果 获得了一株新的产冷活性β-...     

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在HepG2及GRC细胞株中的表达

目的：研究阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。方法：质粒pDCβ-在大肠杆菌DH5a中扩增后用碱裂解法提取，并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析，以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2、人肾癌细胞株GRC，然后用X-gal细胞化学染色法检测β-半乳糖苷酶活性。结果：β-半乳糖苷酶活性在HepG2、GRC中均有表达。结论：阳离子脂质体Lipofectin是有效的细胞基因转染剂。     

HCV NS3与CD40L胞外段融合蛋白表达载体的构建及免疫性

目的 构建带有丙肝病毒NS3与CD40L胞外段融合蛋白的重组乳酸球菌表达载体,并探讨其电转乳酸球菌后的免疫原性.方法 在乳酸球菌表达质粒pMG36e的基础上,应用基因重组技术构建重组表达载体pMG36e-NS3-CD40L.该载体电转乳酸球菌MG1363,口服的方式免疫雄性ICR小鼠.ELISA法检测小鼠外周血中抗NS3蛋白抗体,流式法检测小鼠脾T淋巴细胞亚型,CTL杀伤实验检测小鼠脾淋巴细胞的杀伤活性.结果 构建了乳酸球菌表达载体pMG36e-NS3-CD40L,该载体成功电转入乳酸球菌MG1363.ELISA检测结果显示,该重组乳酸菌口服免疫小鼠后,能诱发小鼠产生高滴度的抗NS3抗原的抗体.流式结果证实,该菌能上调小鼠CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞比率,且以CD8+T淋巴细胞增加更为显著.CTL杀伤结果显示,该重组乳酸菌能上调小鼠CTL杀伤能力.结论 成功制备了乳酸球菌表达载体pMG36e-NS3-CD40L,该载体转入乳酸球菌并经口服免疫小鼠后,能够诱发高水平的细胞杀伤活性.     

酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

目的 建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法.方法 采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定最佳酶活测定条件. 结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)＞8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109 中差异有统计学意义(P＜0.001),而在Y187中没有明显差异(P＞0.05). 结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定.     

酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

目的 建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法.方法 采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定最佳酶活测定条件. 结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)＞8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109 中差异有统计学意义(P＜0.001),而在Y187中没有明显差异(P＞0.05). 结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定.     

E.Coli中alkA基因启动子点突变对MNNG作用的表达

目的；研究alkA基因启动子点突变N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)诱导，获得高β-半乳糖苷酶活性表达的突变克隆株，用于抗肿瘤的基因治疗。方法；采用人工突变方法制成alkA基因启动子区点突变，经MNNG诱导后测定点突变株β-半乳糖苷酶活性。结果：共获得点突变株46个，其中插入突变1个，置换突变26个，缺失突变8个，双突变11个。在突变株中，3株受MNNG诱导-β半乳糖苷酶活性表达高于野生型。结论：alkA基因启动子点突变克隆株受MNNG诱导β-半乳糖苷酶活性高于野生型。     

脂肪源性干细胞对内源性皮肤老化的治疗作用

目的 研究脂肪源性干细胞(ADSCs)对内源性皮肤老化的抗衰老作用及机制。 方法 分离培养小鼠皮肤成纤维细胞(MSFCs)及人ADSCs。将MSFCs 分为对照组、模型组、ADSCs条件培养基组。D-半乳糖(D-gal)制备MSFCs衰老模型,ADSCs条件培养基培养。镜下及流式检测ROS、β-半乳糖苷酶活性的变化,RT-PCR 检测caspase3、p53、sirt1基因的表达情况,Western blotting检测Sirt1蛋白表达。 结果 模型组较对照组ROS水平上升(P<0.001)、β-半乳糖苷酶着色增深,而ADSCs条件培养基组较模型组ROS水平降低(P<0.001)、β-半乳糖苷酶着色变浅。RT-PCR检测结果显示模型组较对照组caspase3(P<0.001)、p53(P=0.001)表达升高,sirt1表达下降(P<0.001);而ADSCs条件培养基组较模型组caspase3(P<0.001)、p53(P=0.001)表达下降,sirt1表达升高(P<0.001)。 Western blotting结果显示模型组较对照组Sirt1表达下降(P<0.001),而ADSCs条件培养基组较模型组Sirt1表达升高(P=0.006)。 结论 ADSCs可通过Sirt1通路改善D-gal引起的内源性皮肤老化。     

二至丸对D-半乳糖诱导大鼠肾细胞衰老的保护作用

目的 探讨二至丸对D-半乳糖(D-galactose, D-gal)诱导的大鼠肾(NRK)细胞衰老的保护作用。方法 使用不同浓度D-gal（1、5、10、20、40 g/L）作用不同时间（24、48、72 h）诱导NRK细胞衰老,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色法鉴定细胞衰老;荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷(Fluorescein di-β-D-galactopyranoside, FDG）法检测衰老相关的β-半乳糖苷酶活性;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力;以GSH-PX、SOD活力与MDA含量检测细胞氧化应激水平;构建体外NRK细胞衰老模型。根据FDG的结果来评估不同浓度二至丸(0.01、0.1、1 g/L)处理对衰老NRK细胞的影响,检测GSH-PX、SOD活力与MDA含量的变化来探讨二至丸对衰老NRK细胞的保护作用。结果 与对照组相比,模型组(20 g/L D-gal处理48 h)β-半乳糖苷酶染色阳性率明显增加,β-半乳糖苷酶活性明显增加;GSH-PX、SOD活力下降,MDA含量增加（P<0.05~0.01）,细胞活性无明显变化。与模型组相比,给药组β-半乳糖苷酶含量明显降低,阳性染色率显著下降,GSH-PX、SOD活力升高,MDA含量明显降低（P<0.05~0.01）。结论 建立D-gal诱导的NRK细胞衰老模型;二至丸能够减轻D-gal诱导的NRK细胞衰老的程度,其保护效应的产生可能与二至丸抗氧化应激效应相关。     

重组腺病毒转染兔心肌细胞的实验研究

目的:观察腺病毒载体转染兔心肌细胞的有效性和外源性基因表达的时相性.方法:用Adv5-CAG粘粒(对照组)或Adv5-CAG/LacZ质粒(治疗组)转染兔心肌,转染后第3、7、14、28天取被转染心肌组织行X-gal染色及β-半乳糖苷酶活性检测.结果:X-gal染色示,治疗组转染后第3、7、14、28天注射部位心肌均见蓝染,尤以第7、14天明显,而对照组所有心肌均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示治疗组转染后第3天心肌中即有β-半乳糖苷酶表达,第7、14天表达达高峰,28天表达量明显减少.结论:重组腺病毒载体可成功转染兔心肌细胞,外源性基因在兔心肌细胞中能有效地表达并能维持1个月左右.     

何首乌饮对Leydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响

目的:探讨何首乌饮对eydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响.方法:采用3 β-HSD特异性染色鉴定体外培养的大鼠睾丸Leydig细胞,分为正常组、Leydig细胞衰老损伤组、何首乌饮预防组和何首乌饮治疗组,用50 μ mol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4处理Leydig细胞建立Leydig细胞衰老模型.观察各组Leydig细胞β-半乳糖苷酶表达的变化.结果:正常组Leydig细胞无β-半乳糖苷酶表达.与正常组比较,衰老组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显升高(P＜0.05);何首乌饮预防组、治疗组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显低于衰老组(P＜0.05),何首乌饮治疗组、预防组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:何首乌饮可通过降低β-半乳糖苷酶的表达保护睾丸Leydig细胞衰老损伤.     

大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定

目的：制备大肠杆菌β-半乳糖苷酶（β- galactosidae）酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具有全酶活性的β-半乳糖苷酶。方法：以pSV-β- galactosidase control vector为模板设计引物,用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM-T-easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β-半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果：获得与pSV-β- galactosidase control vector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b-ED及pET20b-EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为14 000及116 000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论：成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β-半乳糖苷酶。     

靶向包膜蛋白的HIV进入抑制剂非感染性定量筛选方法的研究

目的 HIV包膜蛋白能介导细胞与细胞之间的融合,本项目旨在建立一种靶向包膜蛋白的HIV进入抑制剂非感染性定量筛选方法 .方法 将表达包膜蛋白gp120/gp41和Tat等HIV蛋白的HL2/3细胞与表达CD4和由HIV长末端重复片段(LTR)启动的β-半乳糖苷酶的HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞混合,采用氯酚红β半乳糖苷(CPRG)为显色底物检测β-半乳糖苷酶的表达.用特异性的HIV进入抑制剂对检测方法 进行验证.结果 HL2/3细胞与HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞共育不能形成合胞体,但二者能发生膜融合,导致效应细胞表达的Tat蛋白与靶细胞中LTR结合,启动β-半乳糖苷酶的表达.CPRG方法 能灵敏地检测细胞中β-半乳糖苷酶的含量.特异性的HIV进入抑制剂能够抑制β-半乳糖苷酶的表达,且具有剂量依赖性.结论 这一非感染性定量的方法 能客观定量地筛选作用于HIV进入阶段的抗HIV药物,且操作方便、廉价、无感染性,用于天然和合成来源的小分子抗艾滋病药物的筛选.     

β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌对乳糖细胞毒性的缓解作用

目的体外评价β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌缓解乳糖对细胞毒性作用的效果。方法建立乳糖细胞毒性作用Caco-2细胞模型,采用形态学观察及细胞增殖活性等指标检测该菌对乳糖细胞毒性的作用效果。结果成功建立乳糖细胞毒性作用Caco-2体外模型,所构建的β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌能够保护细胞耐受乳糖毒性而呈现正常形态,并能提高乳糖作用下的细胞活性（P〈0．01）。结论β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌在体外可显著的降低乳糖的细胞毒性作用,为进行其食品级改造奠定了基础。     

异常黑胆质成熟剂对D-半乳糖致衰老模型大鼠p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响

目的探讨异常黑胆质成熟剂（ASMq）对D-半乳糖致衰老模型大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响,以此阐明异常黑胆质成熟剂延缓衰老作用的部分机制。方法选取3个月龄雄性 SD 大鼠60只,体质量180～220 g,采用 D-半乳糖制作亚急性衰老模型,随机分为衰老模型组及 ASMq高、中、低剂量组各15只（ASMq高、中、低剂量分别为6．0、3．0、1．5 g·kg-1·d-1）,连续给药21 d。另取15只正常雄性大鼠作为正常对照组。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达。结果各组大鼠心、脑、肝脏组织中 p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达阳性的细胞表现为细胞浆染成黄褐色。与正常对照组比较,衰老模型组心、脑、肝组织中的P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显升高,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）;与衰老模型组比较, ASMq高、中、低剂量组心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显下降,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）。结论 ASMq可降低衰老大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达,从而发挥抗衰老作用。     

保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的扩增及其影响因素

目的 通过扩增得到保加利亚乳杆菌编码高效β-半乳糖苷酶的基因,并探讨影响扩增的因素。方法 采用溶菌酶加冻融法提取细菌DNA;选取不同的模板浓度、退火温度分别进行扩增。结果 模板浓度60ng／μl、退火温度66℃是保加利亚乳杆菌β-乳糖苷酶基因的较优扩增条件。结论 优化了扩增保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶所需的退火温度、模板浓度等条件,提高了扩增产物的产量。     

乳酸乳球菌介导的细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗的构建、鉴定及表达

目的 构建乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, LL)为载体的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)重组LL-Eg95(rLL-Eg95)疫苗,并研究其表达效率。方法 以pCD-Eg95为模板扩增Eg95基因,采用XbaⅠ和HindⅢ双酶切后插入pMG36e,构建重组质粒pMG36e-Eg95,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒进行双酶切鉴定;电穿孔转化乳酸乳球菌MG1363株,构建细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR鉴定。结果 重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小的片段,以具有罗红霉素抗性的重组LL中抽提的质粒为模板进行PCR可扩增出471 bp的Eg95基因;SDS-PAGE显示重组LL可表达相对分子质量为16.5×10³的Eg95蛋白,表达蛋白约占菌体总蛋白的17%;免疫印迹表明表达蛋白可被细粒棘球蚴感染的鼠血清识别。结论 成功构建了细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗,表达的Eg95具有特异的抗原性。     

嗜热芽孢杆菌β-半乳糖苷酶发酵条件研究

以嗜热芽孢杆菌为菌种,研究发酵生产β－半乳糖苷酶的条件。应用均匀设计法优化发酵培养基组成,结果为（ｇ／Ｌ）：乳糖０．５、蛋白胨２．０、牛肉浸膏２．０、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０１。在温度５５℃、初始ｐＨ７．０、摇床转速２００ｒ／ｍ ｉｎ 和１０％ 接种量条件下,发酵２４ｈ,β－半乳糖苷酶酶活力达１３．２Ｕ／ｍ Ｌ。在乳糖水解反应中,证实该酶能催化转半乳糖苷反应,合成半乳糖低聚糖。     

伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备

目的:为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fljB的表达调节机制,建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)插入变异株。方法:采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接KpnⅠ和SalⅠ的特异性引物,用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段,并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体(pSV-β-galactosidase vector)的片段定向连接,将连接片段克隆至自杀质粒pGMB151,再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌,在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果:经筛选获得阳性克隆,经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763 bp被3550 bp的lacZ片段替代。结论:成功构建伤寒沙门菌flj∶∶lacZ突变株,为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。