富血小板血浆对硝普钠诱导的软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:观察富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对硝普钠诱导的软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:取5月龄新西兰大白兔耳静脉血制成富血小板血浆。取兔双膝关节软骨,分离、培养软骨细胞。取培养的第2代软骨细胞,分为空白对照组、硝普钠对照组、PRP组和Wnt蛋白生成抑制剂2(the inhibitor of Wnt production-2,IWP-2)组,空白对照组与硝普钠对照组加入生理盐水、PRP组加入PRP、IWP-2组加入IWP-2干预1 h后,除空白对照组外,其余3组再加入硝普钠干预24 h。采用实时荧光定量PCR法检测各组软骨细胞Wnt1、β-catenin和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)mRNA的表达情况,采用Western-blot法检测各组软骨细胞Wnt1、β-catenin和GSK-3β蛋白表达情况。结果:经甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定所培养细胞为软骨细胞。干预后,4组软骨细胞Wnt1、β-catenin和GSK-3βmRNA相对表达量组间总体比较,差异均有统计学意义(0.429±0.015,0.968±0.058,0.693±0.019,0.228±0.012,F=4.673,P=0.013;0.434±0.021,0.948±0.067,0.702±0.024,0.191±0.011,F=3.918,P=0.008;0.816±0.039,0.225±0.017,0.459±0.018,0.929±0.118,F=3.015,P=0.005)。PRP组软骨细胞Wnt1、β-catenin mRNA相对表达量均较空白对照组和IWP-2组高(P=0.036,P=0.000;P=0.026,P=0.000),但均较硝普钠对照组低(P=0.017;P=0.013)。PRP组软骨细胞GSK-3βmRNA相对表达量较空白对照组和IWP-2组低(P=0.001,P=0.000),但较硝普钠对照组高(P=0.016)。干预后,4组软骨细胞Wnt1、β-catenin和GSK-3β蛋白相对表达量组间总体比较,差异均有统计学意义(0.565±0.017,0.941±0.134,0.725±0.031,0.251±0.013,F=5.062,P=0.017;0.526±0.024,0.872±0.016,0.653±0.016,0.262±0.018,F=3.592,P=0.006;0.753±0.014,0.262±0.015,0.579±0.024,0.823±0.025,F=2.384,P=0.002)。PRP组软骨细胞Wnt1和β-catenin蛋白相对表达量较空白对照组和IWP-2组高(P=0.031,P=0.000;P=0.041,P=0.002),但低于硝普钠对照组(P=0.032,P=0.025);PRP组软骨细胞中GSK-3β蛋白相对表达量较空白对照组和IWP2组低(P=0.035,P=0.011),但高于硝普钠对照组(P=0.010)。结论:PRP可抑制兔膝关节软骨细胞中Wnt1、β-catenin的表达,促进GSK-3β的表达。PRP可抑制硝普钠诱导的软骨细胞Wnt/β-catenin通路活性;但与Wnt蛋白生成抑制剂–2相比,PRP对软骨细胞Wnt/β-catenin通路活性的抑制作用较弱。     

独活寄生汤含药血清抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制研究

目的:探讨独活寄生汤含药血清抑制白细胞介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制。方法:将10只2月龄雄性SD大鼠随机分为正常组和独活寄生汤组,独活寄生汤组以9.3 g·kg~(-1)剂量的独活寄生汤灌胃,正常组给予等量生理盐水灌胃;每日灌胃2次,连续1周;末次灌胃后,经腹主动脉取血,分别制备独活寄生汤含药血清及空白血清,低温保存备用。截取6只4周龄SD大鼠膝关节软骨,采用酶消化法分离并培养软骨细胞,光学显微镜下观察软骨细胞形态,并用Ⅱ型胶原酶免疫组化鉴定。取生长良好的第2代软骨细胞,采用MTT法检测含药血清培养24 h、36 h、48 h、72 h后的软骨细胞活性,采用酶联免疫吸附法测定不同浓度IL-1β干预后软骨细胞的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13含量。将培养好的第2代软骨细胞随机分为空白血清组、模型组、独活寄生汤含药血清组,其中空白血清组以含10%空白血清的培养基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)培养;模型组加入浓度为15 ng·m L~(-1)的IL-1β干预24 h后,采用含10%空白血清的DMEM培养;独活寄生汤含药血清组加入浓度为15 ng·m L~(-1)的IL-1β干预24 h后,采用含10%独活寄生汤含药血清的DMEM培养;3组均连续培养48 h,采用Western blot法检测软骨细胞中G蛋白偶联信号传导系统关键调控因子的蛋白表达情况。结果:(1)软骨细胞形态及免疫组化鉴定结果。第2代软骨细胞胞浆丰富,细胞周围可见具有折光性的细胞外基质,细胞长势呈"铺路石"状,胞浆呈棕黄色阳性染色。(2)独活寄生汤含药血清培养不同时间后的软骨细胞活性。含药血清培养24 h、36 h、48 h、72 h后的软骨细胞活性比较,差异有统计学意义(1.01±0.01,1.03±0.02,1.07±0.01,1.02±0.02,F=8.300,P=0.008)。含药血清培养24 h时的软骨细胞活性低于培养48 h时的软骨细胞活性(t=-4.648,P=0.002);与培养36 h、72 h时的软骨细胞活性比较,差异无统计学意义(t=-1.549,P=0.160;t=-0.775,P=0.461)。(3)不同浓度IL-1β干预后的MMP-13含量。在含IL-1β浓度为0 ng·m L~(-1)、5 ng·m L~(-1)、10 ng·m L~(-1)、15 ng·m L~(-1)、20 ng·m L~(-1)、25 ng·m L~(-1)的DMEM中培养24 h后软骨细胞MMP-13含量比较,差异有统计学意义[(0.07±0.01)ng·m L~(-1),(0.08±0.01)ng·m L~(-1),(0.09±0.01)ng·m L~(-1),(0.10±0.01)ng·m L~(-1),(0.08±0.01)ng·m L~(-1),(0.06±0.01)ng·m L~(-1),F=6.823,P=0.001]。未经IL-1β干预时的软骨细胞MMP-13含量与浓度为5 ng·m L~(-1)、20 ng·m L~(-1)、25 ng·m L~(-1)的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量比较,差异均无统计学意义(LSD-t=-2.049,P=0.055;LSD-t=-2.083,P=0.052;LSD-t=0.496,P=0.626);浓度为10 ng·m L~(-1)、15 ng·m L~(-1)的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量高于未经IL-1β干预时的软骨细胞MMP-13含量(LSD-t=-3.412,P=0.003;LSD-t=-4.216,P=0.001);浓度为10 ng·m L~(-1)的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量与浓度为15 ng·m L~(-1)的IL-1β干预后软骨细胞MMP-13含量比较,差异无统计学意义(LSD-t=-0.804,P=0.432)。(4)软骨细胞中G蛋白偶联信号传导系统关键调控因子的蛋白表达。空白血清组、模型组和独活寄生汤含药血清组的Gαs、Gαq、Gαo和Gαi蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义[(0.81±0.09)k Da,(0.31±0.07)k Da,(0.78±0.13)k Da,F=23.669,P=0.001;(0.22±0.04)k Da,(0.14±0.02)k Da,(0.20±0.02)k Da,F=6.500,P=0.031;(0.25±0.02)k Da,(0.12±0.01)k Da,(0.18±0.03)k Da,F=27.214,P=0.001;(0.21±0.02)k Da,(0.26±0.02)k Da,(0.19±0.03)k Da,F=6.882,P=0.028];空白血清组Gαs、Gαq、Gαo蛋白表达量高于模型组(LSD-t=6.134,P=0.001;LSD-t=7.370,P=0.000;LSD-t=3.465,P=0.013),Gαi蛋白表达量低于模型组(LSD-t=2.572,P=0.042);模型组Gαs、Gαq、Gαo蛋白表达量低于独活寄生汤含药血清组(LSD-t=5.766,P=0.001;LSD-t=3.401,P=0.014;LSD-t=2.599,P=0.041),Gαi蛋白表达量高于独活寄生汤含药血清组(LSD-t=3.609,P=0.011)。结论:独活寄生汤含药血清可以抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应,其作用机制可能与G蛋白偶联信号传导系统的调控有关,但其具体作用靶点有待进一步深入研究。     

独活寄生汤含药血清对白细胞介素1β诱导的退变关节软骨细胞中基质金属蛋白酶和环氧化酶2表达的影响

目的:观察独活寄生汤含药血清对白细胞介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)诱导的退变关节软骨细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)表达的影响。方法:将36只2月龄SD大鼠随机分为独活寄生汤血清组、壮骨关节丸血清组和空白血清组,每组12只。分别以独活寄生汤、壮骨关节丸溶液和生理盐水灌胃,每次0.6 m L,每天2次,连续7 d。末次给药后采血,分离血清备用。将体外培养的SD大鼠第3代关节软骨细胞分为空白组、模型组、独活寄生汤组和壮骨关节丸组。模型组、独活寄生汤组和壮骨关节丸组软骨细胞加入IL-1β干预24 h后,分别采用含10%空白血清组血清、独活寄生汤血清组血清和壮骨关节丸血清组血清的DMEM培养基培养;空白组软骨细胞不加IL-1β,直接以含10%空白血清组血清的DMEM培养基培养。培养72 h后采用Western Blot法测定各组细胞中MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2的含量。结果:4组软骨细胞的MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2含量比较,组间差异均有统计学意义(0.135±0.007,0.324±0.006,0.174±0.007,0.234±0.007,F=266.333,P=0.000;0.150±0.028,0.346±0.027,0.250±0.028,0.293±0.028,F=26.855,P=0.000;0.131±0.014,0.283±0.009,0.148±0.014,0.158±0.015,F=50.442,P=0.000;0.173±0.035,0.691±0.051,0.318±0.038,0.286±0.039,F=91.860,P=0.000;0.201±0.033,0.796±0.031,0.370±0.033,0.327±0.034,F=125.270,P=0.000)。空白组的MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2含量均低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000)。模型组的MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2含量均高于独活寄生汤组和壮骨关节丸组(P=0.000,P=0.003,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.047,P=0.000,P=0.000,P=0.000)。独活寄生汤组的MMP-1含量低于壮骨关节丸组(P=0.000);2组的MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2含量比较,组间差异均无统计学意义(P=0.094,P=0.497,P=0.380,P=0.220)。结论:独活寄生汤含药血清可抑制IL-1β诱导的退变关节软骨细胞中MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2的表达,其抑制MMP-1表达的作用优于壮骨关节丸含药血清。     

温阳补肾药对抗骨髓间充质干细胞凋亡的实验研究

目的:探讨温阳补肾药对骨髓间充质干细胞凋亡的影响及作用机制。方法:建立白细胞介素1β诱导体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞凋亡体系,分别向其中加入巴戟天含药血清(A组)、鹿角胶含药血清(B组)、淫羊藿含药血清(C组)、骨碎补含药血清(D组)和空白血清(F组),E组不加入血清。各组细胞培养48 h后,采用RT-PCR法检测bcl-2和Bax的mRNA表达量,采用电泳法检测骨髓间充质干细胞凋亡体系的建立,采用Western Blot法检测bcl-2和Bax的蛋白表达量。结果:①骨髓间充质干细胞表面标记结果。流式细胞仪检测结果显示CD34、CD45表达阴性,CD90表达阳性。②bcl-2和Bax的mRNA表达量。各组bcl-2mRNA表达量比较,差异有统计学意义(22.25±1.15,15.18±1.51,15.36±0.72,16.12±0.95,16.79±1.39,16.02±1.14;F=182.000,P=0.000)。A组bcl-2mRNA表达量高于B组、C组、D组、E组和F组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);E组高于B组(P=0.030)。各组BaxmRNA表达量比较,差异有统计学意义(19.17±0.67,15.37±1.02,18.18±0.23,17.37±0.72,28.36±0.93,23.52±1.26;F=28.422,P=0.000)。A组BaxmRNA表达量高于B组和D组(P=0.001,P=0.018),低于E组(P=0.001);B组低于C组、E组和F组(P=0.013,P=0.000,P=0.000),B组与D组比较,差异无统计学意义(P=0.052);D组低于F组(P=0.000);E组高于C组和F组(P=0.000,P=0.000)。③bcl-2DNA和BaxDNA电泳结果。电泳图谱显示,E组条带与A组、B组、C组、D组有明显差异。④bcl-2和Bax的蛋白表达量。各组bcl-2蛋白表达量比较,差异有统计学意义(11 526.18±697.38,20 096.88±953.73,16 784.88±504.36,14 856.65±546.90,8 549.29±313.63,9 004.79±399.12;F=341.740,P=0.000)。A组bcl-2蛋白表达量低于B组、C组和D组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),高于E组和F组(P=0.000,P=0.000);B组高于C组、D组、E组和F组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);C组高于D组、E组和F组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);D组高于E组和F组(P=0.000,P=0.000)。各组Bax蛋白表达量比较,差异有统计学意义(12 435.09±1002.35,4 590.96±71.45,11 721.90±855.08,10 393.54±662.79,13 874.83±541.16,12 774.15±674.40;F=136.305,P=0.000)。A组Bax蛋白表达量高于B组和D组(P=0.000,P=0.039);B组低于C组、D组、E组和F组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);C组低于E组(P=0.010);D组低于E组和F组(P=0.000,P=0.002)。结论:温阳补肾药含药血清有对抗白细胞介素1β诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的作用,其机制主要是上调抑制凋亡基因Bcl-2的表达,下调促进凋亡基因Bax的表达,抑制其蛋白酶活性从而降低细胞凋亡率。     

河蚌葡聚糖含药血清对软骨细胞β-catenin及MMP-13基因表达的影响

目的探讨河蚌葡聚糖（HBP—A）治疗骨关节炎大鼠6周后的含药血清对软骨细胞β-catenin和MMP一13基因表达的影响。方法采用6周龄的雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组、西药组和中药组,每组5只。采用ACLT造模方法建立膝骨关节炎模型,造模后采取相应的干预措施,连续灌胃6周后采含药血清。软骨细胞依次用2．5％、5％、10％浓度的HBP—A含药血清进行体外培养,分为空白组、模型组、西药组和中药组。培养48h后观察细胞的形态变化,采用PCR实验检测各组细胞β-catenin和MMP-13基因的表达。结果形态学观察发现10％含药血清明显促进细胞增殖,同时伴发细胞老化凋亡现象。5％浓度含药血清培养的β-catenin、MMP-13基因表达较2．5％增加,差异有统计学意义（P〈0．001）。与空白组比较,2．5％、5％的模型组β-catenin和MMP-13基因表达升高,差异有统计学意义（P〈0．001）。与模型组比较,2．5％、5％浓度的西药组和中药组β-catenin、MMP-13基因表达降低,差异有统计学意义（P〈0．001）。与西药组比较,2．5％、5％浓度的中药组β-catenin、MMP-13基因表达降低,差异有统计学意义（P〈0．001）。结论HBP．A含药血清通过降低β-catenin和MMP．13基因的表达起到保护软骨细胞的作用。     

十全大补汤含药血清对A549/DDP细胞株中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的干预作用

目的:探讨十全大补汤对肺腺癌顺铂耐药细胞株(A549/DDP)中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的干预作用。方法:以SD大鼠制备高、中、低剂量(65,32.5,16.25 g·kg-1,10 m L·kg-1)的十全大补汤含药血清和空白对照血清(生理盐水10 m L·kg-1)。培养细胞分为十全大补汤含药血清高、中、低剂量组和空白血清组,采用MTT法检测各组50%抑制浓度(IC50),采用蛋白质印迹法检测各组糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β),p-GSK-3βser9,β-连环蛋白(β-catenin)及survivin蛋白表达。结果:随着十全大补汤含药血清浓度的升高,顺铂(DDP)对A549/DDP细胞的IC50逐渐降低,以中、高剂量组最显著(P0.01);十全大补汤含药血清对A549/DDP细胞浆GSK-3β蛋白的表达无影响,但可显著下调胞浆p-GSK-3βser9蛋白的表达及细胞总β-catenin和survivin蛋白的表达,以中、高剂量组最明显(P0.01)。结论:十全大补汤可通过降低A549/DDP细胞浆p-GSK-3βser9蛋白及细胞总β-catenin,survivin蛋白的表达而影响Wnt/β-catenin信号转导通路,进而发挥对顺铂耐药的增敏作用。     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨脊蛇祛湿胶囊治疗膝骨关节炎的作用机制

目的：探究脊蛇祛湿胶囊通过调控Wnt/β-catenin信号通路治疗膝骨关节炎（KOA）的作用机制。方法：70只大白兔随机分成7组：空白组,模型组,脊蛇祛湿胶囊低、中、高剂量组,盐酸氨基葡萄糖对照组及美洛昔康对照组,每组10只。造模、灌胃干预后,ELISA检测血清Wnt3a、Wnt5a、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、β-catenin、基质金属蛋白酶（MMP）13含量,HE染色观察膝关节软骨病理改变、AB-PAS染色进行Mankin’s评分,免疫组化检测软骨组织Wnt5a、Axin、GSK-3β、β-catenin、MMP13蛋白表达。结果：与空白组比较,模型组Mankin’s评分显著升高（P<0.05）,血清中Wnt3a、Wnt5a、GSK-3β、β-catenin、MMP13含量显著升高（P<0.05）,软骨组织中Wnt5a、GSK-3β、β-catenin、MMP13蛋白表达显著升高（P<0.05）,Axin蛋白表达显著降低（P<0.05）;与模型组比较,各药物组Mankin’s评分显著降低（P<0.05）,血清中Wnt3a、Wnt5a、GS...     

壮骨健膝方含药血清对经IL-1β诱导的大鼠膝关节退变软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路抑制因子蛋白表达的影响

目的观察壮骨健膝方含药血清对大鼠膝关节退变软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路抑制因子Dkk-1、sFRP-3蛋白表达的影响,揭示该方保护膝关节软骨细胞的可能分子机制。方法取清洁级2周龄SD大鼠膝关节软骨细胞,采用含10 ng/mL IL-1β的10%FBS/DMEM培养,干预24 h后制备退变软骨细胞模型,模型鉴定成功后随机分为空白血清组和含药血清组,分别采用含10%大鼠空白血清、10%壮骨健膝方大鼠含药血清的DMEM进行干预,干预24、36、48、72 h时分别采用Western blot法检测软骨细胞Dkk-1、s FRP-3蛋白的表达水平。结果空白血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平随着干预时间延长而逐渐下降,干预48 h和78 h均显著低于24 h(P均0.05);含药血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平随着干预时间延长而逐渐增强,其中干预36 h高于24 h(P0.05),干预48 h和72 h显著高于24 h(P均0.01),干预48 h和72 h高于36 h(P均0.05);与空白血清组同一时间点比较,含药血清组DKK-1、sFRP-3蛋白表达水平在干预36 h、48 h和72 h时均显著增高(P0.05或0.01)。结论壮骨健膝方含药血清可能通过提高Dkk-1、s FRP-3蛋白的表达水平,抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,从而对经IL-1β诱导退变的大鼠膝关节软骨细胞起保护作用,其效果在一个细胞培养换液周期内随培养时间延长而增强。     

消炎散中活血化瘀药含药血清对成软骨诱导下兔骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路及SOX9影响的研究

目的探讨消炎散中活血化瘀药含药血清对成软骨诱导下兔间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)Wnt/β-catenin信号通路及SOX9的影响。方法提取并培养MSCs,先分为成软骨细胞诱导剂组和未成软骨细胞诱导剂组,每组又分为不加血清组、含药血清组、空白血清组、sFRP-3组。采用流式细胞仪检测细胞周期情况,运用RT-PCR、Western Blotting检测Wnt信号通路相关Wnt5a、β-catenin,SOX9基因及蛋白水平表达的变化。结果RT-PCR及Western Blotting显示,活血化瘀含药血清抑制诱导前MSCs表达Wnt5a、β-catenin mRNA和蛋白,促进SOX9 mRNA和蛋白表达,而对诱导后的MSCs促进Wnt5a、β-catenin mRNA和蛋白表达,抑制SOX9 mRNA和蛋白表达。结论消炎散中活血化瘀药含药血清可通过作用Wnt/β-catenin信号通路,改变SOX9的表达水平,进而影响MSCs的软骨分化。     

雪莲强筋壮骨方对膝骨关节炎软骨细胞p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的影响

目的:探讨雪莲强筋壮骨方对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)软骨细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号传导通路的影响。方法:将24只3月龄雄性新西兰大白兔随机分为空白组、模型组、p38阻断剂组及含药血清组,每组6只。除空白组外,其余各组均采用改良Hulth法行KOA造模。造模成功后含药血清组以雪莲强筋壮骨方水煎剂灌胃(10 g·kg~(-1)),其余各组均以等量生理盐水灌胃,每天2次,连续干预7 d后静脉采血,分别制成10%含药血清和10%空白血清的DMEM培养液保存备用。血清制备完成后处死动物,分离膝关节软骨进行软骨细胞培养。空白组和模型组以空白血清进行干预,p38阻断剂组以空白血清和SB203580进行干预,含药血清组以含药血清进行干预。血清干预结束后,分别采用免疫荧光技术和蛋白免疫印迹法检测各组软骨细胞磷酸化p38MAPK水平。结果:免疫荧光检测结果显示,模型组磷酸化p38MAPK表达呈强阳性,p38阻断剂组和含药血清组次之,空白组最弱。蛋白免疫印迹检测结果显示,空白组磷酸化p38MAPK表达最弱,模型组磷酸化p38MAPK表达最强,p38阻断剂组和含药血清组磷酸化p38MAPK表达水平相当,介于空白组和模型组之间。经扫描定量检测,空白组、模型组、p38阻断剂组和含药血清组条带的光密度值分别为0.31±0.06、0.83±0.11、0.58±0.45、0.55±0.56,差异有统计学意义(F=3.872,P=0.034)。空白组的光密度值小于模型组、p38阻断剂组及含药血清组(P=0.007,P=0.031,P=0.038);模型组的光密度值大于p38阻断剂组和含药血清组(P=0.038,P=0.028);p38阻断剂组和含药血清组的光密度值比较,差异无统计学意义(P=0.066)。结论:雪莲强筋壮骨方能阻滞KOA软骨细胞p38MAPK信号传导通路,其效果与p38MAPK阻断剂SB203580相当。     

鳖甲-莪术药对含药血清对MCF-7人乳腺癌细胞的影响

目的基于Wnt/β-catenin信号通路探讨鳖甲-莪术药对含药血清对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。方法细胞悬液加入不同剂量的鳖甲含药血清、莪术含药血清、鳖甲-莪术药对含药血清孵育48、72 h后,用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期,Western blot法检测β-Catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达。结果与空白血清组比较,各含药血清组处理48、72 h均可抑制细胞增殖(P0.05,P0.01);处理48 h后,其G0/G1期细胞比例增加(P0.05,P0.01)、S期细胞比例降低(P0.05,P0.01),β-Catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达均降低(P0.05,P0.01)。结论各组含药血清对MCF-7细胞的增殖均有抑制作用。此外,鳖甲-莪术药对抑制作用高于单独用药,其抗乳腺癌的机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达,下调β-catenin以及β-catenin下游靶基因cyclin D1,c-Myc蛋白表达有关。     

独活寄生汤水提物对退变大鼠椎间盘软骨细胞功能的影响

目的探究独活寄生汤水提物对经IL-1β诱导退变的大鼠椎间盘软骨细胞中Wnt4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1的影响。方法采用机械-酶消化法分离大鼠椎间盘软骨组织,进行软骨细胞体外培养、镜下观察与鉴定,分为正常组、模型组(经10 ng/m L浓度IL-1β造模)、实验1组(独活寄生汤水提物组200μg/m L干预24 h)、实验2组(独活寄生汤水提物组200μg/m L干预48 h)。观察4组大鼠椎间盘软骨细胞中Wnt4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1 m RNA与蛋白的表达及上清液中Sox 9表达。结果 (1)第2代大鼠椎间盘软骨细胞增殖速度快,呈现多边形,胞核清晰,且含有1~2个核仁,融合后出现"铺路石"状,经Ⅱ型胶原法染色后,阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色;(2)与正常组比较,模型组中软骨细胞Wnt 4、GSK-3β、β-catenin m RNA与蛋白表达及上清液Sox 9含量明显提高(P0.05),DKK-1 m RNA与蛋白表达明显降低(P0.05);与模型组比较,实验1组、实验2组中软骨细胞Wnt 4、GSK-3β、β-catenin m RNA与蛋白表达及上清液Sox 9含量明显降低(P0.05),DKK-1m RNA与蛋白表达明显提高(P0.05),以实验2组变化最为显著(P0.05)。结论独活寄生汤水提物组可调控退变椎间盘软骨细胞的功能,下调Wnt 4、GSK-3β、β-catenin和上调DKK-1 m RNA与蛋白表达,进而延缓大鼠椎间盘软骨细胞的退变。     

健脾复方对大肠癌CD44和β-catenin表达的调控作用

目的探讨健脾复方对大肠癌SW620细胞株CD44和β-catenin表达的调控作用。方法采用体外实验,将SW620细胞分别与正常培养基(空白对照组)、正常裸鼠血清培养基(药物空白组)和含药血清培养基(健脾复方组)培养72 h后,采用流式细胞技术检测CD44的表达情况,Western Blot方法检测β-catenin的表达情况。结果空白对照组、药物空白组和健脾复方组的CD44相对表达量分别为0.791±0.008,0.737±0.007,0.533±0.018。经方差分析,3组间比较差异有统计学意义(P0.001);经LSD法两两比较,健脾复方组与空白对照组、健脾复方组与药物空白组比较差异均有统计学意义(P均0.05)。空白对照组、药物空白组和健脾复方组的β-catenin相对表达量分别为1.396±0.437,1.491±0.467,0.671±0.213。经方差分析,3组间比较差异有统计学意义(P=0.004);经LSD法两两比较,健脾复方组与空白对照组、健脾复方组与药物空白组间比较差异均有统计学意义(P均0.05)。结论健脾复方能抑制透明质酸与CD44的结合以及β-catenin的表达,从而起到抗肿瘤的作用。     

牛膝含药血清对骨关节炎软骨细胞P38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的影响

目的:探讨牛膝含药血清对骨关节炎软骨细胞P38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的影响.方法:将20只雄性新西兰大白兔随机分为空白对照组、模型组、P38阻断剂组及含药血清组,每组5只.分组后含药血清组大白兔以牛膝水煎剂灌胃(2.5 g· kg-1),其余各组以等量生理盐水灌胃,每天2次,共3d.3d后静脉采血,分别配成10％含药血清和10％空白血清的DMEM培养液保存备用.除空白对照组外,其余各组大白兔均采用Hulth法行兔膝骨关节炎造模,空白对照组行假手术.造模成功后处死实验兔分离兔膝关节软骨进行软骨细胞培养,对空白对照组、模型组的第3代软骨细胞以空白血清进行干预,P38阻断剂组以SB203580进行干预,含药血清组以牛膝含药血清进行干预.血清干预结束后,分别采用免疫荧光技术和Western Blot技术检测各组软骨细胞磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶及Ⅱ型胶原蛋白含量.结果:①免疫荧光检测结果.各组细胞均有磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶阳性表达,其中模型组呈强阳性表达,P38阻断剂组及含药血清组略弱,空白对照组最弱;各组细胞均有Ⅱ型胶原蛋白阳性表达,其中空白对照组呈强阳性表达,P38阻断剂组及含药血清组略弱,模型组最弱.②Western Blot检测结果.各组磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶含量比较,差异有统计学意义(F =3.872,P=0.038).进一步两两比较,空白对照组(0.463±0.007)小于模型组(0.856 ±0.007)、P38阻断剂组(0.576±0.005)及含药血清组(0.508±0.004),差异有统计学意义(P =0.008;P=0.036;P=0.042);模型组大于P38阻断剂组和含药血清组(P =0.025;P=0.019);P38阻断剂组与含药血清组比较,差异无统计学意义(P=0.058).各组细胞Ⅱ型胶原蛋白含量比较,差异有统计学意义(F=3.963,P=0.034).进一步两两比较,空白对照组(0.884±0.007)大于模型组(0.434±0.007)、P38阻断剂组(0.616±0.003)及含药血清组(0.565±0.008),差异有统计学意义(P =0.007;P =0.031;P =0.038);模型组小于P38阻断剂组和含药血清组(P =0.035;P=0.028);P38阻断剂组与含药血清组比较,差异无统计学意义(P =0.066).结论:牛膝含药血清能阻断骨关节炎软骨细胞P38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路,进而保护软骨细胞,其效果与SB203580相当.     

补肾活血复方含药血清对大鼠成骨细胞磷酸化GSK-3β、p38MAPK及ERK1/2蛋白的影响

目的:观察补肾活血复方含药血清对大鼠成骨细胞磷酸化糖原合成激酶3β(GSK-3β)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白的作用。方法:3月龄SD雌性大鼠灌胃制备空白血清和含药血清,并分离培养1日龄新生鼠颅骨成骨细胞。实验分为空白血清组和含药血清组,分别采用MTT、ELISA、Western-blot等方法检测两组成骨细胞的增殖、ALP和BGP的分泌及磷酸化GSK-3β、p38 MAPK和ERK1/2蛋白的变化。结果:与空白血清组相比,含药血清组可明显促进成骨细胞的增殖、ALP和BGP的分泌,并促进胞内磷酸化p38 MAPK和ERK1/2蛋白的表达,对磷酸化GSK-3β蛋白的表达未见明显影响。结论:补肾活血复方含药血清可促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,提高p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化水平。     

基于Caspase-3/PARP通路探究龟鹿二仙胶及拆方对IL-1β诱导的退变软骨细胞凋亡及细胞外基质的影响

目的 基于半胱氨酸蛋白酶3/多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Caspase-3/PARP)通路探究龟鹿二仙胶及拆方对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的退变软骨细胞凋亡及细胞外基质(ECM)的影响。方法 采用SD大鼠制备空白血清、龟鹿二仙胶含药血清、龟甲胶含药血清及鹿角胶含药血清,采用酶消法体外培养C57BL/6小鼠软骨细胞。将软骨细胞分为5组,空白组加入空白血清培养,模型组加入IL-1β和空白血清培养,龟鹿组加入IL-1β和龟鹿二仙胶含药血清培养,龟板组加入IL-1β和龟甲胶含药血清培养,鹿角组加入IL-1β和鹿角胶含药血清培养,干预24 h后,采用CCK-8法检测软骨细胞活性,采用TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况,采用免疫荧光染色法检测Caspase-3、PARP-1表达情况,分别采用Western blot和qRT-PCR法检测细胞中Caspase-3、PARP-1、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白及mRNA表达情况。结果 与空白组比较,模型组软骨细胞活性明显降低(P<0.05),软骨细胞凋亡率明显升高(P<0.05);细胞中Cas...     

毒痰瘀脾虚方含药血清对HepG2肝癌细胞影响的实验研究

目的:研究毒痰瘀脾虚方含药血清对Hep G2肝癌细胞Wnt/β-catenin信号通路中相关基因及细胞侵袭、迁移、凋亡的影响。方法:采用RT-qPCR实验观察毒痰瘀脾虚方含药血清对Hep G2肝癌细胞Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin mRNA、MMP2 mRNA、Cyclin D1 mRNA表达的影响;Transwell细胞侵袭和迁移实验,观察其对Hep G2肝癌细胞侵袭和迁移的影响;AnnexinV-FITC双染流式细胞法检测其对Hep G2肝癌细胞凋亡的影响。结果:RT-qPCR结果显示,与阴性组比较,毒痰瘀脾虚方含药血清能下调HepG2肝癌细胞Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin mRNA、MMP2 mRNA、Cyclin D1 mRNA的表达,差异有统计学意义(P0.01或P0.05);Transwell细胞侵袭实验和迁移实验结果显示,毒痰瘀脾虚方含药血清能抑制Hep G2细胞的侵袭(P0.01),对细胞的迁移无明显影响(P0.05);细胞凋亡实验结果显示,毒痰瘀脾虚方含药血清能促进Hep G2细胞的凋亡,与阴性组比较,差异有统计学意义(P0.01)。结论:毒痰瘀脾虚方含药血清能抑制Hep G2细胞侵袭,促进细胞凋亡,并能抑制Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin mRNA、MMP2 mRNA、Cyclin D1 mRNA表达。     

龟甲胶和鹿角胶含药血清对豚鼠骨关节炎软骨细胞JNK及p38 MAPK基因表达的影响

目的:通过实验观察龟甲胶、鹿角胶含药血清对豚鼠膝骨关节炎软骨细胞促增殖作用以及两种含药血清对JNK及p38 MAPK基因表达的影响,揭示龟甲胶及鹿角胶治疗膝骨关节炎的作用机制。方法:分别用龟甲胶、鹿角胶、盐酸氨基葡萄糖(GHC)含药血清及生理盐水对3月龄豚鼠骨关节炎软骨细胞进行干预,MTT法比较含药血清对软骨细胞的促增殖情况,QPCR检测含药血清干预后软骨细胞JNK及p38 MAPK基因的表达情况。结果:用含药血清浓度为5%的各组培养液干预后(时间72h),龟甲胶组、鹿角胶组、氨基葡萄糖组和空白对照组MTT法检测OD值分别为0.468±0.017,0.425±0.010,0.337±0.017,0.276±0.027,结果显示差异有统计学意义(P0.05)。QPCR检测龟甲胶组、鹿角胶组、盐酸氨基葡萄糖组和空白对照组JNK mRNA相对表达量分别为0.162±0.096,0.333±0.165,0.653±0.141,1.000±0.000,差异有统计学意义(P0.05)。QPCR检测龟甲胶组、鹿角胶组、盐酸氨基葡萄糖组和空白对照组p38MAPK mRNA相对表达量分别为0.058±0.025,0.229±0.057,0.441±0.090,1.000±0.000,结果显示差异有统计学意义(P0.05)。结论:龟甲胶和鹿角胶都能有效减少豚鼠骨关节炎软骨细胞JNK及p38 MAPK基因的表达,对软骨细胞作用为促增殖,对其凋亡产生抑制作用,从而一定程度上减缓骨关节炎的病损进展。     

独活寄生汤对骨关节炎软骨退变的影响及其作用机制

目的:探讨独活寄生汤对骨关节炎软骨退变的影响及其作用机制。方法:将45只8周龄雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、独活寄生汤组,每组15只。模型组、独活寄生汤组采用改良Hulth法建立膝骨关节炎大鼠模型,空白组不做任何处理。独活寄生汤组给予9.3 g·kg-1的独活寄生汤水煎浓缩液进行灌胃,模型组和空白组给予等剂量生理盐水灌胃;每天灌胃1次,连续灌胃12周。末次灌胃后分别取各组大鼠双侧股骨髁,采用HE染色观察关节软骨组织形态,并采用Mankin's关节软骨组织学评分法评价软骨退变程度;采用Western blot法检测软骨中G蛋白偶联信号传导系统的关键调控因子的蛋白表达情况。分别从模型组和独活寄生汤组各取50 mg关节软骨组织,采用基因芯片检测软骨基质降解基因表达情况。结果:(1)软骨组织形态。空白组关节软骨结构层次清晰,潮线完整,软骨表面较为平滑;模型组关节软骨结构层次较为紊乱,未见潮线,表层软骨膜破损,膜样结构消失并呈丝绒样;独活寄生汤组关节软骨结构层次较为清晰,软骨破坏程度比模型组轻。(2)软骨退变程度。3组大鼠关节软骨的Mankin's组织学评分比较,差异有统计学意义[(3.46±2.04)分,(12.58±2.55)分,(7.75±1.91)分,F=13.114,P=0.006];空白组和独活寄生汤组低于模型组(t=-5.114,P=0.002;t=2.709,P=0.035);空白组与独活寄生汤组比较,差异无统计学意义(t=-2.406,P=0.053)。(3)药物干预后G蛋白偶联信号传导系统关键调控因子的蛋白表达。3组大鼠G蛋白偶联信号传导系统关键调控因子Gαs、Gαq、Gαo、Gαi蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义[(1.59±0.09)kDa,(1.01±0.04)kDa,(1.45±0.14)kDa,F=29.760,P=0.001;(1.03±0.06)kDa,(0.53±0.04)kDa,(0.75±0.09)kDa,F=14.969,P=0.027;(0.36±0.02)kDa,(0.11±0.01)kDa,(0.17±0.02)kDa,F=204.105,P=0.000;(0.20±0.02)kDa,(0.56±0.05)kDa,(0.33±0.07)kDa,F=28.357,P=0.001];空白组Gαs、Gαq、Gαo表达量均高于模型组(t=0.407,P=0.000;t=0.546,P=0.012;t=1.933,P=0.000),Gαi表达量低于模型组(t=-0.750,P=0.000);模型组Gαs、Gαq、Gαo表达量均低于独活寄生汤组(t=-5.584,P=0.001;t=-2.431,P=0.093;t=-4.584,P=0.004),Gαi表达量高于独活寄生汤组(t=4.377,P=0.005);独活寄生汤组Gαs、Gαq表达量与空白组比较,组间差异均无统计学意义(t=-1.816,P=0.119;t=-3.029,P=0.056);独活寄生汤组Gαo表达量低于空白组(t=-14.749,P=0.000),Gαi表达量高于空白组(t=3.119,P=0.021)。(4)药物干预后关节软骨基质降解基因的表达。药物干预后,表达上调2倍以上的软骨基质降解基因为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)8、硒蛋白P(selenoprotein P,SELP),表达下调2倍以上的软骨基质降解基因为蛋白聚糖酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)1、ADAMTS2、ADAMTS8、钙黏蛋白3(cadherin 3,CDH3)、胶原(collagen,COL)1A1、COL5A1、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、整合素(integrin,ITG)b1、ITGb4、MMP12、MMP14。模型组MMP8、SELP基因表达量均低于独活寄生汤组(1.00±0.00,2.81±0.60,t=-5.225,P=0.035;1.00±0.00,2.31±0.81,t=-2.808,P=0.107),ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS8、CDH3、COL1A1、COL5A1、CTGF、ITGb1、ITGb4、MMP12、MMP14基因表达量均高于独活寄生汤组(1.00±0.00,0.21±0.05,t=27.366,P=0.001;1.00±0.00,0.31±0.16,t=7.458,P=0.018;1.00±0.00,0.11±0.04,t=38.538,P=0.001;1.00±0.00,0.30±0.23,t=5.271,P=0.034;1.00±0.00,0.12±0.09,t=17.380,P=0.003;1.00±0.00,0.09±0.16,t=10.168,P=0.010;1.00±0.00,0.21±0.30,t=4.605,P=0.044;1.00±0.00,0.37±0.20,t=5.456,P=0.032;1.00±0.00,0.13±0.22,t=6.960,P=0.020;1.00±0.00,0.05±0.08,t=19.388,P=0.003;1.00±0.00,0.05±0.10,t=15.671,P=0.004)。结论:独活寄生汤可以明显延缓骨关节炎软骨的退变,其作用机制可能是通过激活G蛋白偶联信号传导通路而抑制软骨基质降解,从而使受损的软骨组织修复,但其具体作用靶点有待进一步深入研究。     

补肾舒脊颗粒含药血清对人骨髓间充质干细胞Wnt5a、β-catenin mRNA及蛋白表达的影响

目的探讨补肾舒脊颗粒延缓异位骨化的可能作用机制。方法体外培养人骨髓间充质干细胞(BMSCs)分为空白组、模型组、对照组及中药高、中、低剂量组。空白组加入基础培养基(3.8 ml)+5%正常大鼠血清(0.2 ml);模型组加入诱导培养基(4.8 ml)+5%正常大鼠血清(0.2 ml);西药组加入诱导培养基(3.8 ml)+5%洛索洛芬钠含药血清(0.2 ml);中药高、中、低剂量组分别加入诱导培养基(3.8 ml)+5%补肾舒脊颗粒含药血清(0.2 ml)。28天后通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western blot)检测Wnt5a mRNA、β-catenin mRNA及蛋白表达。结果与空白组比较,模型组Wnt5a、β-catenin蛋白及mRNA表达均升高(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,对照组和中药各剂量组Wnt5a、β-catenin蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,中药高剂量组Wnt5a mRNA、β-catenin mRNA表达降低,中药中剂量组Wnt5a、β-catenin蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01);与中药低、中剂量组比较,中药高剂量组Wnt5a mRNA、β-catenin mRNA表达降低(P<0.05或P<0.01)。与中药低剂量组比较,中药中剂量组Wnt5a蛋白表达降低,中药高剂量组β-catenin蛋白表达升高(P<0.05)。结论补肾舒脊颗粒可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制Wnt5a mRNA、β-catenin mRNA及蛋白的表达,从而起到延缓强直性脊柱炎异位骨化的作用。