双转基因小鼠模型中microRNA-153对RTN4的表达调控

目的 探讨mir-153在阿尔茨海默病发病机制中的作用.方法 通过microRNA芯片及Real-timePCR检测APPswe/PSAE9双转基因小鼠脑内mir-153的表达;构建高表达mir-153的稳转细胞系,通过western-blot检测稳转细胞系内RTN4的蛋白表达;构建野生型及突变型RTN4的3'UTR荧光素酶报告载体,分别将其与mir-153表达载体或microRNA阴性对照载体共转染入293T细胞内,检测海肾荧光素酶的相对活性以验证mir-153对RTN4 mRNA的作用靶点.结果 microRNA芯片及Real-time PCR检测均证实3月龄APP8we/PS△E9双转基因小鼠脑内mir-153的表达较同龄野生对照显著降低;在高表达mir-153的稳转细胞系内RTN4的蛋白水平明显降低;共转染野生型RTN4的3'UTR/mir-153表达载体可使海肾荧光素酶相对活性较共转染野生型RTN4的3'UTR/miRNA阴性对照质粒组显著降低(P＜0.05),而共转染突变型RTN4的3'UTR/mir-153表达载体组则较之无明显差异.结论 在3月龄APPswe/PS△E9双转基因小鼠脑内存在mir-153的异常表达;mir-153可调控RTN4的蛋白表达;mir-153对RTN4的表达调控是通过结合RTN4 3'UTR 839-845碱基处的作用位点而实现的.     

转基因植物乳杆菌对雌性大鼠生殖发育的影响

目的 探讨转基因植物乳杆菌对连续传代雌性大鼠生殖发育的影响.方法 将雌雄SD大鼠分组,6只雌性一笼,6只雄性一笼.对照组与实验组,分别为一笼雌和一笼雄.对4周龄SD大鼠进行灌胃,对照组予以非转基因植物乳杆菌,实验组予以转基因植物乳杆菌,连续灌胃4周后进行雌雄配对,对子一代、子二代、子三代进行同样的灌胃实验8周.比较两组雌性大鼠不同时间点身长、尾长、体质量、肛殖距、卵巢质量、激素水平.结果 对照组与实验组子一代、子二代、子三代雌性大鼠灌胃同时间点比较,身长、尾长、体质量、肛殖距差异无统计学意义(P＞0.05).无论是对照组还是实验组,灌胃同时间点子一代、子二代、子三代雌性大鼠身长、尾长、体质量、肛殖距均有不同程度的增加,但差异无统计学意义(P＞0.05).子一代、子二代、子三代雌性大鼠比较,对照组与实验组初级卵泡、次级卵泡、黄体计数、雌二醇、孕酮、阴道开口时间差异无统计学意义(P＞0.05).无论是对照组还是实验组,子一代、子二代、子三代雌性大鼠初级卵泡、次级卵泡、黄体计数、雌二醇、孕酮均有不同程度的增加,阴道开口时间均有不同程度的减少,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 转基因植物乳杆菌对连续传代雌性大鼠生殖发育无明显影响.     

Pin1在皮肤组织中的表达以及可诱导转基因小鼠模型的建立

目的 观察Pin1在皮肤中的表达情况,构建Pin1在皮肤中可诱导表达的转基因小鼠模型。方法 将小鼠Pin1基因克隆到改造过的可与Myc标签蛋白融合的pTRE2载体中,并将线性化的DNA通过显微注射的方式构建TRE-Pin1小鼠。结果 我们成功获得TRE-Pin1转基因首建鼠,该小鼠与上皮特异的K14-rtTA转基因小鼠配繁,获得Pin1在皮肤上皮特异性的可诱导表达的双转基因小鼠;我们通过将多西霉素（又名强力霉素, Doxycycline）加入饮水的方式诱导Pin1基因的表达,并通过Western blot,免疫组织化学等方式证明了Pin1蛋白在皮肤上皮中能特异性地过表达。我们还发现内源的Pin1在皮肤中主要表达于上皮细胞。结论 我们成功地构建Pin1在皮肤中可诱导表达的转基因小鼠模型,为后续研究Pin1在皮肤中的功能奠定基础。     

化疗药物联合细胞因子对bcr-abl转基因小鼠骨髓细胞生长及转基因表达的影响

应用Ｈｕ或５Ｆｕ和鼠干细胞因子（ｍＳＣＦ）及鼠白细胞介素３（ｍＩＬ３）培养含金属硫蛋白（ＭＴ）启动子和增强子序列、ｂｃｒａｂｌｃＤＮＡ（ｐ２１０）序列及ＳＶ４０剪切和Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列的转基因慢粒白血病小鼠骨髓细胞,观察化疗药物及细胞因子单独或联合应用对ＭＴ／ｐ２１０（ｂｃｒａｂｌ）转基因小鼠骨髓细胞生长的影响,并采用ＲＴＰＣＲ分析培养前后骨髓细胞中转基因的表达。结果表明,ｍＳＣＦ和ｍＩＬ３联合应用时,明显促进骨髓细胞增殖及集落形成;不加细胞因子培养,则细胞增殖和转基因表达均受抑制;Ｈｕ或５Ｆｕ与ｍＳＣＦ及ｍＩＬ３联合应用时,同样抑制细胞增殖及转基因表达。提示联合应用化疗药物及细胞因子治疗ＣＭＬ是具有极好应用前景的策略。     

氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响

目的：研究氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的作用,并初步探讨其作用机制。方法：以乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠ＩＣＲ－ＴｇＮ（ＨＢＶａｄｒ１．２）ＳＭＭＵ 为动物模型,运用ＥＬＩＳＡ和免疫组化的方法检测小鼠肝脏内乙肝抗原含量。结果：分别予氧化苦参碱１００, ２００, ３００ ｍ ｇ／ｋｇ 腹腔注射,１次／ｄ,３０ ｄ 后,乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较空白对照组（予等体积生理盐水腹腔注射）均有明显的下降,且对两者作用一致;进一步的研究表明氧化苦参碱２００ ｍ ｇ／ｋｇ 作用１０ ｄ,２０ ｄ 时小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较治疗前有明显的下降。结论：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量,有抗乙型肝炎病毒作用。     

慢病毒介导APP695基因RNAi对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元β淀粉样蛋白分泌的影响

目的 探讨慢病毒介导RNA干扰(RNAi)抑制APP695基因表达对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元细胞分泌β淀粉样蛋白(Aβ)的影响.方法 构建靶向APP695基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒表达质粒(pFU-GW-iRNA),进行酶切和测序鉴定.慢病毒表达质粒与包装质粒(pHelper 1.0和Helper 2.0)共转染293T细胞,获得病毒浓缩液并测定滴度.使用APP695-shRNA慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,设定为慢病毒介导阳性干扰(APP695-RNAi)组,另设阴性对照病毒感染(NC)组、未经病毒感染(CON)组.采用实时荧光定量PCR检测APP695基因mRNA的表达,Western印迹检测APP695蛋白的表达,采用Elisa检测Aβ40和Aβ42的生成.结果 PCR扩增和测序结果证实,APP695 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为5×108 TU/ml.使用慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,实时荧光定量PCR检测APP695-RNAi组APP695基因mRNA的抑制率为76.70%,与NC组和CON组相比差异有统计学意义(P＜0.001).Western印迹结果显示蛋白水平表达下降与定量PCR一致.Elisa检测干扰72 h后APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ40的分泌分别为(184±15)ng/L、(647±30)ng/L、(656±40)ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义(均为P＜0.001);APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ42的分泌分别为(19.2±1.9)ng/L、(67.6±6.0)ng/L、(68.6±7.0)ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义(均为P＜0.001).结论 慢病毒载体介导的APP695基因RNA干扰可以有效抑制痴呆小鼠皮质神经元细胞Aβ40和Aβ42的分泌.     

利用乳腺特异表达微RNA转基因小鼠探索乳汁微RNA对子代个体发育的影响

【立论依据】 乳汁是新生儿及婴儿阶段重要的营养来源,其中含有多种免疫球蛋白、脂类以及生长因子等免疫、营养相关物质。近年发现,在哺乳动物乳汁中存在丰富的微RNA(microRNA)。微RNA主要发挥转录后水平基因表达调控作用,参与了多种生理病理过程。目前研究多集中于对乳汁中微RNA存在的证实与含量的检测,尚未见基于直接实验证据获得的乳汁中微RNA对子代个体生长发育作用的报道。据此,我们拟利用转基因模式小鼠对乳汁微RNA是否对子代个体生长发育有影响进行探索。 【设计思路】 首先,针对乳腺特异表达微RNA(miR-X)转基因小鼠乳腺组织及乳汁中miR-X进行定量;其次,利用该miR-X转基因小鼠及野生型小鼠分别哺育野生型新生小鼠,通过对新生小鼠生长发育情况的检测,初步判定乳汁miR-X对子代发育的影响;最后,检测新生小鼠主要脏器miR-X靶基因表达情况。 【实验内容】 利用已建立的乳腺特异表达miR-X的转基因小鼠,分别进行基因组、乳腺组织以及乳汁的外源基因整合情况检测及miR-X的表达及含量检测。实验组用阳性雌鼠哺育野生型新生小鼠,观察并记录小鼠生长发育情况;对照组用野生型雌鼠哺育野生型新生小鼠,观察并记录小鼠生长发育情况。4周后处死部分子代小鼠,取其肝脏等主要脏器,测定miR-X相关靶基因表达情况。 【材料】 乳腺特异表达miR-X转基因雌鼠8只,野生型雌鼠(C57Bl/6)8只及用于合笼繁殖的野生型雄鼠; 【可行性】 乳汁微RNA的存在已被多项研究所证实,为本项目的提出提供了依据;乳汁中营养成分对子代个体的生物学作用已被证实,其中微RNA也必将具有一定的生物学作用。项目组所在实验室具有相关研究经验和仪器设备可保障实验的实施。乳腺特异表达微RNA转基因小鼠的建立为本项目提供了直接可靠的实验材料。 【创新性】 乳汁微RNA对子代个体发育的功能研究将丰富人们对乳汁功能的认识,为改良母乳替代品配方提供了更加直观的依据,为奶制品新的质量检测指标的提出提供了理论基础。此外,乳腺特异表达微RNA转基因小鼠是该项目的重要材料,也是本项目的特色。     

破坏高尔基体对小鼠体细胞核移植重组胚的构建及其体外发育的影响

目的探讨破坏高尔基体对小鼠核移植重组胚的构建及其体外发育的影响;方法采用血清饥饿法同步化处理KM小鼠成纤维细胞作为供体细胞;常规超排KM小鼠获得卵母细胞,布雷菲德菌素A（Brefeldin A,BFA）特异性破坏其高尔基体并采用盲吸法去核;直接注核法构建重组胚胎,6-DMAP＋CCB＋乙醇激活重组胚,在含5μg/mL BFA的CZB培养液中培养。结果经BFA处理后,小鼠核移植重组胚的存活率降低,与对照组存活率相比较统计学差异显著（P〈0.05）,但其卵裂率与对照组比较统计学差异不显著（P〉0.05）;     

葛花解酲方对乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变细胞周期调控因子表达的影响

目的观察葛花解酲方对乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)及p27细胞周期调控因子蛋白表达的影响,探讨葛花解酲方阻断肝癌癌前病变的作用机制。方法将24只HBV转基因小鼠适应性饲养1周后,随机分为对照组、模型组、治疗组,每组8只。各组小鼠于22周末进行取材光镜观察肝组织病理学改变并用免疫组织化学法检测Cyclin D1、CDK4及p27KIP1蛋白的表达。结果与模型组比较,给药组肝组织病理形态学得到明显改善;与对照组比较,模型组Cyclin D1和CDK4阳性表达率显著升高(P0.05);与模型组比较,治疗组Cyclin D1和CDK4阳性表达率显著下降(P0.05);与对照组比较,模型组p27KIP1阳性表达率显著降低(P0.05),与模型组比较,治疗组p27KIP1阳性表达率显著升高(P0.05)。结论葛花解酲方可以通过下调癌基因Cyclin D1和CDK4的表达,上调抑癌基因p27KIP1的表达,从而达到保护肝脏损害、逆转肝癌癌前病变的作用。     

TACE在着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞中的表达及其抗体对胚泡粘附的影响

目的:通过检测肿瘤坏死因子α转换酶(Tumor necrosis factor α convening enzyme,TACE)在小鼠子宫内膜上皮细胞中的表达及其在体外着床模型中对胚泡粘附的影响,初步探讨TACE在小鼠生殖中的作用以及其与胚胎着床的关系.方法:体外培养孕4d(d4)小鼠子宫内膜上皮细胞和胚泡,构建胚泡体外着床模型;通过细胞免疫组化鉴定小鼠子宫内膜上皮细胞;运用RT-PCR和细胞免疫组化分别检测小鼠子宫内膜上皮细胞中TACE mRNA和蛋白的表达;向体外着床模型中添加不同浓度的TACE抗体,观察对胚泡体外着床的影响,并用细胞免疫化学检测抗体干预后各培养体系中TACE蛋白质的表达情况.结果:原代培养小鼠子宫内膜上皮细胞生长旺盛,鉴定结果显示:上皮细胞对角蛋白抗体有棕黄色阳性表达,对波形蛋白抗体为阴性表达.PCR结果显示TACE mRNA在共培养体系中有高表达,免疫组化结果与RT-PCR结果相一致;小鼠胚泡体外共培养具有较高的粘附率,添加TACE抗体后胚泡帖附率均显著低于对照组帖附率(P<0.05),且随着抗体浓度的降低胚泡粘附率随之升高,免疫化学检测结果也显示随着抗体浓度的降低TACE的表达量随之升高.结论:TACE可能参与了胚泡着床过程,有利于小鼠胚胎粘附、扩展,为胚胎的着床做准备.     

转基因RNA干扰小鼠的制备及应用

RNA干扰作为一种有效的工具用来产生基因转录后沉默的效果,从而抑制特定基因的表达,已经得到成功应用。转基因RNAi小鼠的出现,使得该技术在哺乳动物中研究靶基因的敲低成为可能。本文综述了转基因RNAi小鼠的制备方法,转基因RNAi小鼠的应用并展望了转基因RNAi小鼠对功能基因组研究的贡献以及应用前景。     

Effect of Spermatozoa Apoptosis on the Clinical Outcomes with Human in vitro Fertilization

Objective To analyze the effect of spermatozoa apoptosis on the clinical outcomes during in vitro Fertilization (IVF-ET). Methods A prospective analysis was carried out, 519 infertile couples were divided into 3 groups according to the clinical outcomes with IVF, including pregnancy and birth (liveborn group), pregnancy but abortion (miscarriage group), failure to pregnancy (failure group). Spermatozoa collected from 519 male partners were processed through density gradient centrifugation (DGC) and swim-up and the apoptosis of the spermatozoa, in ejaculated / processed semen, were evaluated using flow cytometry by determining the levels of disruption of mitochondrial membrane potential (d-MMP) and activation of caspase-3 (CP3). Results For ejaculated semen, apoptosis was significantly different among 3 groups individually, the result was as follows: liveborn group < failure group < miscarriage group (P<0.05). For processed semen, miscarriage had the highest apoptosis level (P<0.05), and there was no significant difference between liveborn group and failure group (P>0.05). Compared with the d-MMP, the activation of CP3, either in ejaculated or processed semen, showed more powerful predictive value for miscarriage other than liveborn and failure. The cutoff value of CP3 in ejaculated semen was 42.0%, with sensitivity: 0.931, specificity: 0.804. Conclusion The level of apoptosis of spermatozoa played a strongly impact on the clinical outcomes with IVF and the activation of CP3 in ejaculated semen possessed a high predictive value for miscarriage.     

转绿色荧光蛋白基因小鼠子宫内膜异位症模型的建立和评价

目的建立小鼠子宫内膜异位症种植模型,探讨荧光检测异位子宫内膜的方法。方法将转绿色荧光蛋白(GFP)基因小鼠的子宫内膜剪碎后,注射入C57BL/6小鼠的腹腔,喂养含17-β-雌二醇的无菌水,3周后剖检小鼠,在活体荧光成像系统下观察腹腔的绿色荧光,并做免疫组化染色。结果在移植转GFP基因小鼠子宫内膜的C57/BLC57BL/6小鼠的腹腔内存在绿色荧光,且免疫组化证实该异位内膜组织中表达GFP,而对照组均阴性。结论转GFP基因小鼠子宫内膜模型可清晰地显示异位内膜病灶,具有良好的应用前景。     

影响小鼠冻融精子体外受精率的主要因素探讨

目的分析影响小鼠精子冷冻成功的因素。方法用含3％脱脂奶和18％棉子糖的冷冻保护剂分别冷冻C57BL／6J、FVB／NJ、B6D2F1、KM和ICR小鼠精子。复苏后，评价小鼠精子的冷冻效果和受精能力。结果各品系小鼠精子冷冻前后的受精率不同；新鲜精子体外受精时，C57BL／6J、FVB／NJ、B6D2F1，KM和ICR五个品系的小鼠的受精率分别为81．4％、87．2％、90．4％、82．7％和79．4％而冻融精子的体外受精率分别为6．7％、46．0％、76．8％、59．2％和31．9％，差异极显著（P〈0．01）。结论遗传背景不同的小鼠品系，精子的受精能力及对冷冻的耐受能力不同。     

C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎的冷冻保种技术.方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测.结果 体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的平均复苏率是67.78％,移植产仔率是21.31％,后代的阳性率是23.08％;体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,平均复苏率是63.33％,移植产仔率是15.78％,后代的阳性率是33.33％.结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法.     

C57-ras癌症转基因小鼠模型冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型的冷冻保种技术。 方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测。结果 冷冻体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的复苏率是67.78%?.08,移植产仔率是21.31%?.09,后代的阳性率是23.08%?.14;冷冻体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,复苏率是63.33%?.03,移植产仔率是15.56%?.04,后代的阳性率是33.33%。 结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法。     

体外受精与胚胎移植术后妊娠的围生情况

【目的】研究体外受精与胚胎移植 (IVF ET)妊娠的围产情况。【方法】应用病例对照方法 ,在控制孕周、妊娠胎数及分娩方式情况下 ,选择在中山医科大学附属第一医院行IVF ET妊娠并在本院住院分娩的 92例产妇与同期、同数量自然妊娠产妇 92例作对照 ,研究IVF ET妊娠的围生情况。【结果】IVF ET妊娠与同样胎数的自然受孕婴儿体重及主要产科并发症如妊高征、产后出血、胎膜早破、死胎、新生儿窒息、糖耐量异常无明显差别 ,但IVF ET妊娠的多胎妊娠的并发症较单胎妊娠高 ,胎儿体重明显较低。【结论】IVF ET技术对宫内妊娠胎儿生长无明显影响。     

剖宫产与体外授精技术在小鼠生物净化中的应用

目的 采用剖宫取胎和体外受精对微生物级别达不到SPF级的小鼠进行生物净化.方法 对于具有正常繁殖能力的小鼠品系,通过对阴道栓的检查和触诊确定剖宫产取胎时间,采用子宫摘除手术对小鼠进行剖宫产,取出仔鼠用SPF级受体母鼠代乳,观察代乳情况及代乳仔鼠成活率;对于繁殖力较差或者丧失繁殖能力的品系,采取辅助生殖的方式,采集小鼠精子和卵子,在HTF液中受精,培养3.5 d后的胚胎移植到SPF级受体母鼠子宫内,待产仔.结果 两种方式净化的小鼠断奶后进行微生物检测,均达到SPF级.结论 对微生物级别达不到SPF级但不含垂直传播病原体的小鼠,采用两种方式可有效提高小鼠的微生物等级.     

PCR技术在转人肾素基因小鼠繁殖保存及育种中的应用

应用聚合酶链反应(PCR,Polymerase Chain ReacLion)方法检测转基因小鼠繁殖及育种过程中外源基因的整合,筛选携带目的基因的阳性仔鼠。     

钩端螺旋体在不同宿主巨噬细胞内存活能力的比较

目的通过比较钩端螺旋体(钩体)在人和小鼠单核-巨噬细胞内的存活情况,探讨固有免疫在钩端螺旋体病致病机制中的作用。方法将钩体秋季血清群强毒株56606v株及其经体外多次传代的弱毒株56606 a株在体外分别感染经佛波酯(PMA)诱导分化的人单核细胞系THP-1和小鼠单核-巨噬细胞系RAW 264.7。感染后2、24、72 h,采用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察并计算两种细胞的含菌细胞百分数;感染后2、12、24、48和72 h,采用Real-Tim e PCR技术定量检测可间接反映细胞内钩体存活数量的钩体16S rRNA的表达。结果随着感染时间的延长,两种细胞的含菌细胞百分数逐渐降低;Real-Tim e PCR检测结果显示:随着感染时间的延长,两种细胞内钩体16S rRNA的表达逐渐下调,细胞内钩体的存活数量逐渐减少。结论钩体在人和小鼠单核-巨噬细胞内均不能存活和繁殖,提示致病性钩体通过抗巨噬细胞的杀灭降解而在胞内的存活和繁殖可能不是钩体感染人类宿主的主要致病途径,其发病机制有待进一步阐明。