乌头碱对KBv200细胞PgP蛋白表达影响的研究

乌头碱是温阳散寒代表中药附子、乌头的主要成分之一。现代研究表明，乌头碱具有抑制肿瘤与抗肿瘤转移、缓解癌性疼痛、增强巨噬细胞的吞噬等作用。研究中发现。乌头碱能够增加长春新碱对KBv200细胞敏感性，推测机制与乌头碱能够抗耐药有关。KBV200细胞株具有Pgp蛋白高表达的生物学特征。为进一步证实乌头碱逆转肿瘤多药耐药效应，     

乌头碱影响KBV200细胞Pgp蛋白表达的组化实验

目的:通过观察Pgp蛋白表达的细胞阳性率探讨乌头碱抗KBV200细胞耐药机制。方法:以免疫组化法,分别测定6.25μg/mL、12.5μg/mL乌头碱作用后的KBV200细胞Pgp蛋白阳性表达率。结果:对照组Pgp蛋白表达的阳性细胞为96%;而6.25μg/mL、12.5μg/mL乌头碱作用后Pgp蛋白表达的阳性细胞率分别为83%、30%。结论:乌头碱能够降低KBV200细胞Pgp蛋白高表达,部分逆转KBV200细胞耐药性。     

乌头碱抗耐药性人口腔鳞状上皮癌细胞作用的体外研究

目的观察温阳药附子、乌头主要成分乌头碱单用及与长春新碱伍用后的抗癌效果.方法以耐药性人口腔鳞状上皮癌细胞(KBv200)为研究对象,采用细胞体外孵育技术中MTT比色法测定乌头碱的抗癌效果.结果不同浓度的乌头碱能够增加长春新碱对KBv200细胞杀伤的敏感性.结论乌头碱能增加化疗药物的敏感性,其在抗耐药肿瘤方面具有潜在的研究价值.     

中药活性成分体外逆转肿瘤细胞多药耐药性的研究

目的：从中药活性成分中筛选肿瘤耐药逆转剂,并对其逆转作用进行研究。方法：采用MTT法测定药物的体外杀伤作用,应用金氏公式进行联合用药分析。结果：钩藤总碱5μg/ml、药根碱2μg/ml、肯定玉红1．25μg/ml对长春新碱在KBv200细胞的逆转倍数分别为16．8、5．1和4倍;姜黄素1．56－12．5μg/ml与长春新碱合用对KB和KBv200细胞均具增敏作用。结论：钩藤总碱、药根碱、靛玉红均可逆转kBv200细胞对长春新碱的耐药性,而姜黄素与长春新碱合用对KB和KBv200细胞均具增敏作用。     

延胡索乙素逆转多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7

目的:探讨延胡索乙素(Tetrahydropalmatine,Tet)逆转人乳腺癌细胞MCF-7多药耐药的作用机制.方法:采用SRB法测定药物对细胞的毒性作用;通过免疫细胞化学技术分析药物对细胞 Pgp、Lrp、Mrp、Gst、TopoⅡ等多药耐药相关蛋白表达的影响.结果:Tet在浓度小于2.5μg/ml时对MCF-7无毒性作用,2.5μg/ml 的Tet可明显逆转MCF-7/ADM耐药细胞的耐药性.MCF-7/S细胞不表达Pgp,而高表达TopoⅡ;MCF-7/ADM细胞Pgp高表达,但TopoⅡ低表达.Lrp、Mrp、Gst在MCF-7/S及MCF-7/ADM中的表达无明显差异.加入Tet后MCF-7/ADM细胞Pgp蛋白的表达明显下降,Topo的表达显著升高,其它几种蛋白的表达无明显变化.结论:Tet具有逆转MCF-7细胞MDR的作用,主要通过下调肿瘤细胞内Pgp的表达、上调TopoⅡ的表达而达到逆转耐药的效果.     

次乌头碱对乳大鼠原代培养心肌细胞Ca2+及Cx43表达的影响

目的 观察次乌头碱对原代培养的心肌细胞内Ca2+浓度及缝隙连接蛋白Cx43表达的影响.方法 体外培养乳大鼠心肌细胞,采用流式细胞技术观察30,60,120 μmol/L的次乌头碱在15,30,60 min对心肌细胞内Ca2+浓度变化的影响,并应用Western blot技术检测次乌头碱作用心肌细胞15 min后的细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达水平.结果 次乌头碱能提高心肌细胞[ Ca2+]i,这种作用在给药后15 min时最显著,随着作用时间的延长,细胞[Ca2+]i下降;次乌头碱作用心肌细胞15 min能降低心肌细胞Cx43的表达量,但无显著性差异.结论 次乌头碱能促进心肌细胞内Ca2+增高,进而导致细胞Cx43表达降低,增加心肌细胞发生心律失常的易感性.     

乌头碱逆转KB_(V200)细胞多药耐药性体外研究

目的 :在既往实验研究基础上 ,进一步考察乌头碱逆转肿瘤多药耐药效应。方法 :采用MTT比色法 ,分别测定VCR、乌头碱对KBV2 0 0 细胞毒效应 ,计算IC50 。并以抑制率低于 30 %的不同浓度乌头碱与VCR伍用 ,求IC50 值 ,计算逆转倍数。结果 :12 5 μg ml与 6 2 5 μg ml浓度的乌头碱与VCR伍用时 ,IC50 分别为 0 2 715 μg ml与 0 9185 μg ml ,逆转倍数分别为 8 9倍与 2 6 4倍。结论 :乌头碱具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用 ,值得进行深入研究。     

利用基因芯片技术研究乌头碱抗KBV200细胞耐药机制

目的采用基因芯片技术研究乌头碱抗KBV200细胞耐药机制。方法提取乌头碱12.5μg/mL用药组和对照组KBV200细胞的RNA,进行cDNA微阵列分析。结果整张基因芯片5504个基因克隆,其中用药前高表达基因208个,占克隆总数的3.8%,用药后高表达基因196个,占3.6%。用药前后细胞凋亡相关基因、CDKS家族、SMADS家族、MAPK信号转导系统等的基因发生变化。结论乌头碱可能通过影响细胞凋亡相关基因和影响MAPK信号转导系统等机制,最后作用于Mdr1基因的表达,从而起到抗耐药作用。     

青蒿素及其衍生物逆转肿瘤耐药作用初探

目的探讨青蒿素及其衍生物的抗肿瘤耐药作用。方法以体外培养的耐药性人口腔鳞状上皮癌KBv200细胞株为研究对象,采用MTT法测定青蒿素、二氢青蒿素及青蒿琥酯对KBv200细胞的增殖影响和增敏指数。结果青蒿琥酯、二氢青蒿素对肿瘤细胞增殖的抑制作用比青蒿素强。不同浓度的青蒿素能够部分增加长春新碱对KBV200细胞杀伤的敏感性。结论二氢青蒿素及其青蒿琥酯能强烈抑制KBv200的细胞增殖;青蒿素能增加化疗药物的敏感性。     

乌头碱逆转KBv200细胞多药耐药性体外研究

目的:在既往实验研究基础上,进一步考察乌头碱逆转肿瘤多药耐药效应.方法:采用MTT比色法,分别测定VCR、乌头碱对KBV200细胞毒效应,计算IC 50.并以抑制率低于30%的不同浓度乌头碱与VCR伍用,求IC50值,计算逆转倍数.结果:12.5μg/ml与6.25μg/ml浓度的乌头碱与VCR伍用时,IC50分别为0.2715μg/ml与0.9185μg/ml,逆转倍数分别为8.9倍与2.64倍.结论:乌头碱具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用,值得进行深入研究.     

EGCG对两株耐药肿瘤细胞的细胞毒增敏作用及抑瘤作用研究

目的:研究EGCG对人耐药肝癌细胞BEL7404/Adr和耐药口腔癌细胞KBV200的细胞毒增敏作用及对裸鼠移植瘤的抑瘤作用。方法:MTT法检测药物对体外培养细胞的毒性作用,采用BEL7404/ADR或KBV200细胞种植于裸鼠皮下,建立耐药肿瘤模型,观察用药后对裸鼠体重、抑瘤率、病理改变以及RTPCR和免疫组化法分别检测瘤组织mdr1和P糖蛋白的表达。结果:EGCG在100mg/L以下剂量对两株耐药肿瘤细胞的抑制率均小于10%,EGCG与抗肿瘤药物联合应用可明显提高抗肿瘤药物的细胞毒作用;体内与抗肿瘤药物联合应用对两种肿瘤抑瘤率明显高于单用抗肿瘤药物组,mdr1mRNA和Pgp的表达下降。结论:EGCG与抗肿瘤药物联合应用可增强化疗药物对耐药肿瘤细胞BEL7404/Adr和耐药口腔癌细胞KBV200的细胞毒作用,机制可能与降低MDR1mRNA表达、降低Pgp表达有关。     

温下方含药血清诱导A549/DDP细胞凋亡及对Bcl-2,Bax,p53蛋白表达的影响

目的:研究温下方含药血清诱导人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP凋亡及对Bcl-2,Bax,p53蛋白表达的影响。方法:制备温下方含药血清,高效液相色谱法(HPLC)定性检测含药血清中人参皂苷Rb1、大黄素和乌头碱。A549/DDP细胞分为DDP干预组,含药血清+DDP干预组,正常血清+DDP干预组。孵育24 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,激光共聚焦显微镜检测Bcl-2,Bax及p53蛋白表达。结果:HPLC结果显示含药血清中含有人参皂苷Rb1、大黄素及乌头碱。含药血清作用后,与DDP干预组比较,含药血清+DDP干预组细胞凋亡率增高至(21.82±3.27)%(P<0.05);细胞内Bcl-2蛋白表达降低至2.81±0.02(P<0.05);Bax蛋白表达增高至2.90±0.08(P<0.05);p53蛋白表达增高至3.58±0.09(P<0.05)。结论:温下方含药血清明显诱导A549/DDP细胞凋亡,显著降低Bcl-2蛋白表达,提高Bax,p53蛋白表达,可能从诱导耐药细胞凋亡角度逆转耐药。     

次乌头碱对H_2O_2致大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

目的:探讨次乌头碱对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤所致细胞凋亡的保护作用及其可能的分子机制。方法:采用250ng/ml的次乌头碱预处理心肌细胞,之后加入100μmol/L的H2O2,应用MTS方法检测细胞的增殖活力,流式细胞术AnnexinV/PI检测细胞凋亡率,Western Blot检测凋亡蛋白Caspase3和9的表达。结果:100μmol/LH2O2可引起心肌细胞凋亡增加,而次乌头碱预处理后,心肌细胞增殖活力及凋亡率可明显改善,并显著减少了Caspase3和9蛋白的表达。且次乌头碱单独处理组与正常对照组相比心肌细胞增殖活力、凋亡率及Caspase3和9的蛋白表达均未见明显变化。结论:适宜浓度的次乌头碱对H2O2所致的心肌细胞凋亡有明显的改善作用;其机理可能与其降低凋亡蛋白的表达,增加细胞的增殖活力相关。     

乌头碱抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大

研究乌头碱(aconitine,AC)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导H9c2细胞肥大的抑制作用,并探讨其作用机制。通过AngⅡ诱导H9c2细胞肥大建立模型,并分别与不同浓度的乌头碱共同处理,Western blot法检测atrial natriuretic peptide(ANP)、brain natriuretic peptide(BNP)、β-myosin heavy chain(β-MHC)、α-smooth muscle actin(α-SMA)在蛋白水平的表达;实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测肥大基因ANP,BNP,β-MHC mRNA的表达。采用激光扫描共聚焦显微镜检测肌原纤维中的重要组成成分F-actin标记的荧光强度。乌头碱可明显逆转AngⅡ所诱导的H9c2细胞总蛋白含量的升高; qRTPCR检测结果显示乌头碱可明显抑制AngⅡ所诱导的ANP,BNP,β-MHC mRNA的上调; Western blot法检测提示乌头碱可明显抑制AngⅡ所诱导的ANP,BNP,β-MHC蛋白的上调;荧光标记检测F-actin的表达水平,乌头碱可以抑制AngⅡ所诱导的F-actin的表达。乌头碱明显下调AngⅡ所诱导的心肌细胞肥大的多项指标,揭示乌头碱可能通过抑制肥大因子的上调来缓解AngⅡ所引起的心肌肥大,这可能是乌头碱发挥治疗作用的机制之一。     

盐酸小檗碱抑制实验性大鼠胃癌前病变细胞Bcl-2表达作用的研究

传统中药黄连的主要有效成分小檗碱具有利胆、抗炎、抗肿瘤的作用,近年来的研究表明[1]盐酸小檗碱能够诱导人胃癌细胞凋亡,笔者的研究也证实了这一点(另文发表).本研究以实验性大鼠胃癌前病变为模型,免疫组化与RT-PCR技术相结合,从蛋白及mRNA表达两个水平,探讨盐酸小檗碱对Bcl-2基因表达水平的影响.     

青藤碱合用乌头原碱对CD4~+ T细胞RANKL表达和破骨细胞生成的影响

目的:研究青藤碱和乌头原碱单独或配伍使用对活化的T淋巴细胞RANKL表达和两药合用对破骨细胞生成的影响。方法:采用anti-CD3激活小鼠CD4~+T细胞,用流式细胞仪检测青藤碱、乌头原碱对小鼠辅助性T细胞RANKL表达的影响;同时用TRAP染色法观察两药合用对RANKL诱导破骨细胞生成的影响。结果:0.25~1mmol/L青藤碱能够剂量依赖性地抑制小鼠CD4~+T细胞RANKL表达;0.25、0.5mmol/L乌头原碱也能显著地降低CD4~+T细胞RANKL表达,而另一毒性较大的活性成分苯甲酰乌头原碱只在高剂量0.5mmol/L时才能下调RANKL表达。乌头原碱与低浓度青藤碱合用后能使CD4~+T细胞RANKL表达进一步降低,而苯甲酰乌头原碱与低浓度青藤碱合用后对RANKL表达无影响。研究发现,青藤碱与乌头原碱合用后对RANKL诱导的RAW264.7细胞分化成破骨细胞的抑制作用较两药单独使用明显增强。结论:青风藤和附子活性成分均可能通过下调活化的T细胞RANKL表达间接抑制RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收,改善类风湿性关节炎引起的骨破坏;附子久煎后的无毒活性成分乌头原碱与青藤碱配伍使用后对T细胞RANKL表达和RANKL相关破骨细胞生成的作用均优于单用,提示中医临床使用附子时久煎不仅能够减毒,还可能更有利于配伍其它药物治疗类风湿性关节炎骨破坏。     

浙贝母逆转白血病(肿瘤)细胞耐药的临床与实验研究

研究目的:研究中药浙贝母逆转白血病(肿瘤)细胞多药耐药的作用.研究内容:①临床研究:将90例急性白细胞患者分为治疗组(48例,在常规化疗方案的基础上同时加用浙贝母粉口服)及对照组(42例,选用常规化疗方案),两组在正规化疗疗程后,按缓解情况统计临床疗效.结果:在临床安全剂量下,浙贝母粉与常规化疗方案合用,可以明显降低白血病患者骨髓细胞耐药蛋白p-糖蛋白的表达;降低骨髓中白血病细胞百分比;明显提高急性白血病患者,尤其耐药蛋白p-糖蛋白高表达的病例和难治、复发病例的完全缓解率.②实验研究:从浙贝母总生物碱中分离得到的贝母碱甲素、贝母碱乙素是主要活性成分,属于异甾类生物碱中的瑟闻琴类生物碱.是通过直接抑制p-糖蛋白的表达,减少抗癌药物的"泵"出,增加抗癌药物在耐药肿瘤细胞内的蓄积的.③作为新药开发的前期研究:对浙贝母总生物碱进行了药效、毒理、药理以及药代动力学的探索性研究.     

乌头碱对心肌细胞内ATP酶及相关离子的影响

目的:研究乌头碱对心肌细胞内Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶的活性;Na+、Ca2+、K+含量以及钙超载的影响;探讨乌头碱对乳鼠心肌细胞生物电活动的影响。方法:不同浓度的乌头碱处理原代心肌细胞,通过Na+、Ca2+、K+检测试剂盒和Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶检测试剂盒检测以上各指标的改变;使用激光扫描共聚焦显微镜,检测在不同浓度乌头碱给药下钙瞬变的发生;并利用Real-time PCR法及Western blot技术对不同浓度乌头碱处理组进行mRNA及蛋白的检测。结果:乌头碱低(1μmol/L)、中(μmol/L)、高(10μmol/L)剂量组作用于心肌细胞后,细胞内Na+,Ca2+浓度上升,而K+浓度降低,并且不同程度的降低了Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性;乌头碱低(1μmol/L)、中(5μmol/L)、高(10μmol/L)剂量组作用于心肌细胞后,各自与空白组相比,不同浓度乌头碱均可抑制钙瞬变浓度,高浓度乌头碱可以显著增加钙瞬变频率,以及增加钙离子浓度;乌头碱对SERCA2的mRNA与蛋白表达显著下调,对RyR2的mRNA与蛋白表达显著上调,结果具有浓度依赖性。结论:乌头碱在高剂量时对心肌细胞具有明显的毒性作用,毒性机制可能与调节心肌细胞膜以及细胞内各离子的浓度有关。乌头碱可以调节钙离子通道相关蛋白SERCA2、RyR2的mRNA与蛋白质水平的表达,这种调节作用可能与乌头碱的毒性机制有关。     

自噬在乌头碱诱导H_9C_2心肌细胞凋亡中的作用及机制研究

目的:观察自噬在乌头碱诱导H_9C_2心肌细胞凋亡中的作用,并对其作用机制进行初步探讨。方法:以0.05%、0.1%、0.2%、0.4%浓度的乌头碱分别对H_9C_2心肌细胞作用30、60、90、180 min,采用MTT法测定乌头碱对H_9C_2心肌细胞的增殖抑制作用;0.05%乌头碱作用H_9C_2心肌细胞不同时间后,应用MDC荧光染色观察自噬的发生,Hoechst 33342/PI荧光双染观察凋亡的发生;并通过Western blot法检测自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的变化。结果:乌头碱对H_9C_2心肌细胞增殖有显著的抑制作用,且该作用呈时间及浓度依赖性;MDC荧光染色和Hoechst 33342/PI双染检测结果显示乌头碱给药后可诱导H_9C_2心肌细胞发生自噬和凋亡;Western blot检测结果显示,自噬特异性蛋白LC3B和Beclin-1被激活,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达升高。用3-MA抑制自噬后,可下调LC3B、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达。结论:乌头碱能抑制H_9C_2心肌细胞的生长,并诱导其发生自噬和凋亡,此过程中自噬和凋亡可能为拮抗作用,3-MA特异性抑制自噬后可增加乌头碱诱导的H_9C_2心肌细胞凋亡。