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蜂毒溶血肽前体蛋白cDNA的克隆及其融合蛋白的表达 总被引:8,自引:0,他引:8
从蜜蜂毒腺中提取总RNA ,通过RT PCR扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的cDNA ,将扩增产物克隆到 pT7Blu T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到 pUC1 1 8载体上 ,构建了重组质粒pUMP。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的cDNA序列与所发表序列完全相同 ,且与 β 半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框。含重组质粒 pUMP的大肠杆菌DH5α表达了与β 半乳糖苷酶部分序列融合的蜂毒溶血肽前体蛋白 相似文献
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蛙皮素-蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与诱导表达 总被引:3,自引:0,他引:3
抗菌肽 (Antibacterialpeptides)原指昆虫体内经诱导产生的一类分子量在 4kD左右 ,具有抗菌活性的碱性多肽物质[2 ] 。这类抗菌剂最初是从昆虫、哺乳动物、两栖动物等的防御系统中分离得到的。抗菌肽对革兰氏阳性及阴性细菌、病毒、原虫和发生病变的真核细胞等有杀伤作用 ,具有很强的广谱抑菌作用 ,但对正常哺乳动物细胞无杀伤作用[3 ] 。蛙皮素还具有抗肿瘤活性而没有溶血活性[4 ] ,虽然蜂毒素具有溶血活性 ,但其溶血功能区位于C端的亲水区域[5] ,两者的极性区域正好相反。据研究表明抗菌肽都会形成两亲螺旋结构的… 相似文献
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4种胡蜂前溶血肽原基因的克隆与序列比较 总被引:4,自引:1,他引:4
从雌性亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂毒腺中抽提总RNA,通过RT-PCR方法扩增得到4种胡蜂蜂毒前溶血肽原的cDNA,再将扩增产物克隆到pGEM⑥-Teasy vector上。测序结果表明:扩增得到的片段长度均为213bp,系蜂毒前溶血肽原编码区的cDNA。经序列比较,4种胡蜂蜂毒前溶血肽原之间的氨基酸序列同源性都超过95%。亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂各自与意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原氨基酸序列的同源性分别为95.8%、100%、97.2%、97.2%。结果表明:蜂毒前溶血肽原一级结构序列具有很高的保守性,尽管胡蜂和蜜蜂属于膜翅目不同的总科,但它们的前溶血肽原基因却非常相似。 相似文献
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将中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AcPLA2)蛋白成熟肽编码区基因(405 bp)克隆至表达载体pETBlue-1,在大肠杆菌Tuner(DE3)plac I中诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,表达产物分子量为15kD,约占细菌总蛋白的4.6%;用意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)纯品制备的兔源多克隆抗体为一抗作Western blot,表达产物显示类似于天然纯AmPLA2的特异性印迹,证实AcPLA2基因已在大肠杆菌中得到表达。 相似文献
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蜘蛛杀虫肽在大肠杆菌中的表达及其活性分析 总被引:2,自引:0,他引:2
以T7为启动子构建了蜘蛛杀虫肽基因的表达质粒pTHI19,转化大肠杆菌BAL31,在其对数生长期加入1mmol/L IPTG能诱导杀虫肽的产生,表达产物占菌体总蛋白的13.75%,并且表达的杀虫肽具有功能活性。 相似文献
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用聚合酶链式反应(PCR)改造了锂鱼生长激素基因,扩增出编码锂鱼生长激素成熟肽的序列,并将此序列克隆到pBluescript Ⅱ KS质粒中,序列分析后,亚克隆到大肠杆菌表达载体pBV220中。经SDS-PAGE和薄层扫描,结果表明锂鱼生长激素基因已大肠杆菌中获得表达。锂鱼生长激素成熟肽的分子量为22000道尔顿,表达率占细胞总蛋白的18%以上%。 相似文献
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克隆鉴定猪硒蛋白Sep15基因( Sep15 ),将其突变实现原核表达,为以猪为模型研究Sep15功能奠定基础。实验以RT-PCR从猪脾总RNA扩增出含开放阅读框(ORF)至poly(A)共1230 bp的 Sep15 cDNA,3'-非翻译区Sec插入元件为2型,489 bp的ORF及对应氨基酸序列与人相应序列的相似度分别为85.1%和92.7%,ORF含一个硒代半胱氨酸(Sec)密码子TGA,定点突变为半胱氨酸(Cys)的TGC后,经载体pET30转入大肠杆菌BL21(DE3),0.4 mmol/L IPTG诱导表达3 h获得融合表达产物;该产物在Western blot检测中与人Sep15 Sec下游肽段的商品化多抗产生特异性免疫印迹。猪 Sep15 被首次成功克隆并鉴定,其Cys突变体的原核表达产物与人Sep15 C-端抗体存在交叉免疫反应。 相似文献
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首次将9种人工定点诱变的G6PD基因转化至G6PD缺陷的大肠杆菌HB351(DE3)中表达,并对突变酶的生物学功能进行研究。初步证实G6PD基因m1376 G to T(Arg 459keu),1388 G to A(Arg 463 His)突变可降低酶活性并引起酶动力学改变。这可能与取代氨基酸的化学结构、所带电荷的性质及极性有关。这两个部位的精氨酸在酶与NADP~ 的结合过程中亦起到重要作用。赖氨酸取代精氨酸对酶与NADP~ 的结合影响不大。引入无义突变,证实G6PD第459位以后的氨基酸对酶活性有重要影响。 相似文献
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乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达 总被引:2,自引:0,他引:2
节杆菌BT801的乙内酰脲酶系能够水解5-苄基乙内酰脲生成L-苯丙氨酸,其中乙内酰脲水解酶负责乙内酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重要意义。通过PCR技术扩增得到乙内酰脲水解酶基因(hyuH),置于表达载体pT221的,17启动子下游,将构建的重组质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析在相对分子量50kD处有一较强的表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40%,主要以可溶性形式存在,活性分析表明表达产物具有天然的酶活性。 相似文献
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Taq DNA耐热聚合酶在大肠杆菌中的克隆和高表达 总被引:5,自引:0,他引:5
从水生栖热菌(Thermus aquaticus)YT-1中分离得到的Taq DNA 聚合酶是一种广泛应用于PCR的耐热DNA聚合酶。由于天然菌株酶产量较低,培养条件要求严格,酶的纯化过程极为繁琐而使产品成本较高,因而促使人们构建适合于大规模生产的基因工程菌株。已有人分别通过不同的途径,使用不同的载体,成功地在大肠杆菌菌株中表达了Taq 耐热DNA聚合酶基因。我们通过与前人不同的途径,把这一基因克隆到大肠杆菌的载体质粒pJLA503上并使其得以高表达,为降低生产成本和进一步研究该酶的各种特性提供了有利条件。 相似文献
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转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从轮枝链霉菌Streptoverticilliummobaraense细胞中获得其基因组DNA ,用一对特异性的引物通过PCR的方法扩增出转谷氨酰胺酶 (transglutaminase,TGase)全长基因 ,回收片段并将其连接到表达载体pET30a中 ,转化大肠杆菌DH5α。双向测序表明获得的转谷氨酰胺酶全长基因序列正确。纯化重组质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以 1mmol/LIPTG诱导 5h收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析 ,与阴性对照相比 ,明显多出了一条蛋白条带 ,紫外扫描显示此带约占总蛋白量的1 7% ,Westernblotting证实此带能够特异性地与兔抗MTG(味之素公司 )的抗体发生反应。测得纯化后得到的TGase蛋白的酶活可以达到 15.1U/mg蛋白。 相似文献