Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定

目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.     

Th17细胞在乙肝肝硬化患者中的免疫致病机制研究

目的 探讨IL-17+CD4+T细胞(Th17细胞)在乙肝肝硬化患者中的免疫致病机制.方法 选择2008年7月一2011年12月收治的乙肝肝硬化患者60例及健康对照30名,采用流式细胞仪检测外周血Th17细胞频率及IL-17受体表达情况,ELISA法检测外周血血浆中IL-17水平,并检测IL-17刺激后人肝星状细胞LX-2中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及细胞因子IL-6、IL-8和IL-23p19的表达情况.结果 与健康对照相比,乙肝肝硬化患者外周血Th17细胞频率和血浆IL-17浓度均显著升高(P＜0.01),Th17细胞频率随肝功能损害程度的加重而增高,Child分级C级患者体内Th17频率最高,与A级患者相比差异有统计学意义(P＜0.05).LX-2细胞在IL-17刺激后IL-17受体表达上调,同时α-SMA表达也明显上调(P＜0.05),并产生了炎症相关细胞因子IL-6、IL-8和IL-23p19.结论 Th17细胞的增加不但与乙肝肝硬化患者肝功能损害程度密切相关,而且通过分泌IL-17促进了肝星状细胞的活化,加快了肝硬化的疾病进程.     

2型糖尿病对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响及对策研究

目的 探讨2型糖尿病对乙肝疫苗接种免疫效果的影响及免疫对策.方法 选择4个免疫预防接种中心的76例成人2型糖尿病患者(2型糖尿病组),并以70例同期接受预防接种、年龄及性别匹配的健康个体作为对照(对照组).观察2组完成1个标准乙肝疫苗免疫接种程序后1、12、24个月的抗HBs阳转率和几何平均滴度(GMT),ELISA法...     

要明确乙型肝炎病毒感染控制的阶段和目标

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染不仅是一个医学问题,也是一个社会、心理问题.发生在不同年龄或处于不同阶段的HBV感染可产生截然不同的后果,控制HBV感染应重视对其阶段和目标的认识.乙肝疫苗的接种对于控制HBV感染的流行率具有重要意义.确定为慢性HBV感染者的人群,不能不加区分地在第一时间开始进行抗病毒治疗,而应按照慢性HBV感染的4个阶段(免疫耐受期、活动期、静止期和再活动期),在每个阶段采取不同的抗病毒策略.干扰素(IFN)α、拉米夫定(LAM)等是治疗慢性乙型肝炎(CHB)的一线药物,CHB患者的抗病毒治疗应该追求临床结局的改善,而不是病毒学、免疫学和组织学短期指标的变化.对处于肝硬化、肝细胞癌阶段的患者也应根据情况进行积极的抗病毒治疗.针对慢性HBV感染者的抗病毒治疗是最终控制HBV感染不可或缺的环节,虽然目前已经取得了一些成绩,但任务仍十分艰巨.     

趋化因子CXCL10 G-201A单核苷酸多态性与HBV感染慢性化和重症化关系的研究

目的 检测趋化因子CXCL10(IP-10)启动子区G-201A位点的单核苷酸多态性(SNP),探讨其与乙型肝炎病毒(HBV)感染慢性化及重症化的关系.方法 采集302医院792例HBV感染患者血样,包括急性乙型肝炎(AHB)200例、轻中度慢性乙型肝炎(CHB-M)200例、重度慢性乙型肝炎(CHB-S)192例和慢...     

乙肝患者外周血单核细胞比例与肝脏病变程度的关系研究

目的探讨乙肝患者外周血单核细胞比例与肝脏病变程度的关系。方法收集2010-2011年解放军302医院明确诊断的轻中度慢性乙型肝炎患者197例(肝炎组)、乙肝肝硬化患者248例(肝硬化组),以同期269例健康体检者作为对照组。采用Sysmex XE-2100血液分析仪进行全血细胞分析,实时荧光PCR扩增仪进行血清HBV DNA定量,ELISA法测定血清肝纤维化指标透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(IV.C)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平。共390例患者进行了肝组织活检,参照中华医学会《病毒性肝炎防治方案》(2000年)进行肝脏炎症程度(G0-G4)及纤维化程度(S0-S4)评价。结果全血细胞分析结果表明,肝炎组和肝硬化组外周血单核细胞比例(分别为8.93%±3.05%、9.85%±3.61%)明显高于对照组(8.16%±1.88%,P<0.01),且肝硬化组明显高于肝炎组(P<0.01);血清HBV DNA定量分析表明,239例HBV DNA≥100U/ml的患者单核细胞比例(8.61%±2.83%)显著高于206例HBV DNA<100U/ml的患者(8.12%±2.53%,P<0.05);ELISA检测结果表明,肝硬化组肝纤维化指标HA、LN、IV.C、PCⅢ水平均明显高于肝炎组,且同组内肝纤维化指标升高者的单核细胞比例高于肝纤维化指标正常者;390例患者的肝组织活检病理结果显示,随肝脏炎症及纤维化程度加重,单核细胞比例升高的患者逐渐增多,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。结论乙肝患者外周血单核细胞比例升高与肝脏病变程度关系密切,可在一定程度上反映肝脏的炎症及纤维化水平。     

自体CIKs治疗对乙肝病毒的抑制作用及机制分析

目的探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(CIKs)治疗对乙肝病毒(HBV)的抑制作用及其机制。方法选取2009年4月-2010年12月于解放军302医院住院,且未经抗病毒药物及其他免疫治疗的慢性乙肝患者16例,采集外周血单个核细胞(PBMC)经细胞因子鸡尾酒诱导培养成CIK细胞后,经静脉回输患者体内。观察CIK细胞治疗后24周内患者体内HBV DNA水平、CD3+CD56+细胞频率的变化,以及髓样树突状细胞(mDCs)和浆样树突状细胞(pDCs)频率的改变。结果自体CIK回输后,9例患者产生病毒学应答,其体内HBV DNA水平分别于第41、2及24周(分别为5.70、5.09和4.08log10拷贝/ml)出现明显降低(P<0.05或P<0.01);7例患者表现为病毒学无应答,其体内HBV DNA水平均与在基线时(6.39log10拷贝/ml)无明显差异(P>0.05)。经14d的诱导培养后,病毒学应答者CIK细胞的主要效应细胞CD3+CD56+细胞比例为17.21%,明显高于无应答者(8.97%,P<0.05)。经CIKs治疗后,病毒学应答者pDCs频率由治疗前的0.27%上升至治疗后4周的0.39%(P<0.05)和治疗后12周的0.34%(P<0.05),而病毒学无应答者无明显改变。CIK细胞回输后无明显不良反应。结论 CIK细胞治疗慢性乙肝安全性好,能抑制HBV复制,其机制部分是通过提高pDCs频率实现的。     

G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBV CP变异对下游基因转录活性的影响.方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBV CP片段,克隆至pGEM-T Easy载体.挑选含有CP相关变异位点的质粒,经Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测.结果 患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05).细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍.结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBV CP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用.     

脾脏硬度对肝硬化食管静脉曲张的预测价值

目的 评估脾脏硬度对肝硬化患者食管静脉曲张(EV)的预测价值.资料与方法 回顾性分析80例慢性乙肝肝硬化患者的胃镜检查、Fibro Touch检查与血清学检查资料.以胃镜检查结果为"金标准",将患者分为EV组和非EV组,比较两组患者肝脏硬度值(LSM)和脾脏硬度值(SSM);计算纤维化4项指标(FIB-4)、天冬氨酸氨...     

乙肝后肝硬化中医分型与影像学相关性的研究进展

目前对乙肝后肝硬化的中医分型主要根据患者的症候、脉象、舌象等临床资料进行综合判断,该分型存在主观片面性,并与医师的诊断水平有明确的相关性,严重影响了患者的规范化诊断与中医药治疗。因此,为进一步提高乙肝后肝硬化中医证型分类的准确性,对近年来乙肝后肝硬化中医证型与影像学相关性的研究进展进行探讨,分析超声、CT及MRI对症候分型的价值,以期从影像学的角度为乙肝后肝硬化分型提供客观依据及规范化中医药治疗。     

T_2WI肝门区淋巴结和慢性乙型肝炎的关系

目的:探讨T2WI肝门区淋巴结与慢性乙肝炎症活动度(G)和纤维化程度(S)的关系。方法:经病理证实的慢性乙型肝炎32例,健康成人18例(对照组)。在MR脂肪抑制T2WI上观察肝门区短径>5mm淋巴结的数目、大小和相对信号强度,并分析其与慢性乙型肝炎G和S的关系。结果:肝门区短径>5mm的淋巴结预示G2及以上炎症活动(P<0.05),淋巴结数目≥2为最佳诊断点,敏感度和特异度分别为79.31%和90.47%;淋巴结的存在与S无关。淋巴结的大小与G有相关性(r=0.362,P=0.010),与S无相关性(r=-0.046,P=0.753);淋巴结的相对信号强度与G(r=0.260,P=0.071)和S(r=0.031,P=0.831)均无相关性。淋巴结的大小预示G2及以上炎症活动准确性较高(ROC曲线下面积=0.920,P<0.001),以>90mm2为最佳诊断点,敏感度和特异度分别为89.66%和80.95%。结论:MR脂肪抑制T2WI能显示慢性乙肝肝门区肿大淋巴结。肝门区出现2个及以上、短径>5mm淋巴结或淋巴结大小>90mm2提示G2及以上炎症活动。     

1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.     

乙型肝炎病毒多聚酶区rt229突变的流行特点及其对病毒复制力的影响

目的评价乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶反转录酶(RT)功能域rt229突变对HBV复制力的影响。方法从慢性HBV感染患者血清中提取HBVDNA,使用PCR扩增RT区及前C区基因,采用直接测序法分析耐药相关位点的突变;克隆患者HBV全长基因组,获得S445-3及S869-4克隆并作为定点突变母本,以产生rt229突变的各种模式。使用无载体介导的方法将含有rt229突变的全长HBV基因组转染入HepG2细胞系中,转染3d后采用Real-TimePCR法定量检测HBV复制中间体水平。结果在受检的6000例患者中,394例(6.57%)存在rt229突变,与拉米夫定(LAM)治疗相关的占78.93%,明显高于其他患者[包括接受阿德福韦酯(ADV)治疗、初治和用药不详者]所占的21.07%。其中rtL229V、rtL229W和rtL229M单独突变分别占全部rt229突变的12.44%、1.78%和4.57%,未发现rtL229F单独突变株;rtL229V、rtL229W、rtL229M、rtL229F与LAM耐药突变共存分别占43.65%、9.14%、9.64%和14.97%;rtL229V、rtL229M与ADV耐药突变共存分别占2.54%和1.27%。复制力评价结果显示,相对于前C区G1896A单独突变株(S869-4),rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F突变将HBV复制力降低至2.92%、8.79%、26.04%和34.80%;相对于LAM耐药株(S445-3),伴随有rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F的LAM耐药株的复制力增加了1.18、2.29、2.49和2.51倍。结论 rt229位点的突变可降低HBV的复制力,增强LAM耐药株的复制力;rt229突变可能为LAM耐药突变的补偿突变。     

The association of enlarged periportal lymph nodes on T2 WI with chronic hepatitis B

目的:探讨T2 WI肝门区淋巴结与慢性乙肝炎症活动度(G)和纤维化程度(S)的关系.方法:经病理证实的慢性乙型肝炎32例,健康成人18例(对照组).在MR脂肪抑制T2 WI上观察肝门区短径＞5 mm淋巴结的数目、大小和相对信号强度,并分析其与慢性乙型肝炎G和S的关系.结果:肝门区短径＞5 mm的淋巴结预示G2及以上炎症活动(P＜0.05),淋巴结数目≥2为最佳诊断点,敏感度和特异度分别为79.31％和90.47％;淋巴结的存在与S无关.淋巴结的大小与G有相关性(r=0.362,P=0.010),与S无相关性(r=-0.046,P=0.753);淋巴结的相对信号强度与G(r=0.260,P=0.071)和S(r=0.031,P=0.831)均无相关性.淋巴结的大小预示G2及以上炎症活动准确性较高(ROC曲线下面积=0.920,P＜0.001),以＞90 mm2为最佳诊断点,敏感度和特异度分别为89.66％和80.95％.结论:MR脂肪抑制T2 WI能显示慢性乙肝肝门区肿大淋巴结.肝门区出现2个及以上、短径＞5 mm淋巴结或淋巴结大小＞90 mm2提示G2及以上炎症活动.     

HBsAg和抗HBs双阳性慢性HBV感染患者S区主要亲水区新增N-糖基化突变与肝细胞癌发生风险的相关性研究

目的 探讨临床HBsAg和抗HBs双阳性(简称双阳性)慢性HBV感染患者病毒S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变与肝细胞癌(HCC)发生的相关性.方法 纳入2009年7月-2015年6月在解放军302医院就诊的284例双阳性慢性HBV感染患者,通过巢式PCR方法扩增血清样本HBV S基因全序列并进行测序,分析MHR新增糖基化突变和其他临床指标与HCC发生的相关性并动态分析18例双阳性HCC患者临床确诊HCC前后S区新增N-糖基化的突变情况.结果 多因素分析表明,患者年龄＞40岁、HBsAg＞中位数、HBeAg阴性和MRH新增N-糖基化突变是双阳性慢性HBV感染患者发展为HCC的危险因素(分别为OR=4.281,95％CI 1.843～9.941,P=0.001;OR=3.146,95％CI 1.633～6.060,P=0.001;OR=2.097,95％CI 1.010～4.357,P=0.047;OR=4.381,95％CI 1.842～10.417,P=0.001),而丙氨酸氨基转移酶(ALT)、抗HBs＞中位数、抗HBe阳性和HBV DNA水平与HCC发生均无显著相关性.动态研究结果表明,18例双阳性HCC患者样本中有8例在发生HCC 1～4年前已携有新增N-糖基化突变.结论 在双阳性患者中HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HCC发生密切相关,HBsAg和抗HBs双阳性叠加MHR新增糖基化突变可作为慢性HBV感染患者HCC发生风险的预测指标.     

运用趋势季节模型对医院门诊人次进行预测及评价

随着医院管理步人科学化轨道,以医院统计数据为基础的统计预测,可通过对医院的各项工作进行分析评价,作出科学、全面、准确的预测,从而提高工作的预见性和主动性,为医院管理规划和决策提供科学依据,实现对医院定量的科学管理。本研究应用趋势季节模型预测法,根据2006—2010年某医院门诊人次,对2011年4个季度的门诊人次进行预测,对比2011年前2季度实际门诊量,对预测结果进行评价,旨在为医院科学管理提供依据。     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBV聚合酶基因的突变模式分析

目的 分析慢性乙型肝炎患者在拉米夫定(LAM)治疗过程中出现LAM耐药后,HBV聚合酶基因的突变模式及临床特征.方法 对2005年12月-2007年12月于第二军医大学长海医院住院或感染科门诊诊治的慢性乙型肝炎LAM耐药患者进行HBV聚合酶基因测序,回顾性分析LAM耐药时HBV聚合酶基因的不同突变模式及患者临床特征.结果 215例患者诊断为LAM耐药,192例患者检测到LAM相关的HBV聚合酶基因突变.患者血清HBV DNA水平为6.25±1.31(log10拷贝/ml),ALT中位水平为75U/L(19～821U/L),72.4%(139/192)的患者出现ALT升高、肝炎发作.99.0%(190/192)的患者存在YMDD基序突变,其中4种主要突变类型是:rtM204I(33.9%),rtL180M rttM204V(26.0%),rtLl80M rtM204I(21.9%)rtV173L rtL180M rtM204V(11.5%).与rtM204I相比,rtM204V多以联合rtL180M突变的形式存在(P<0.05).LAM耐药时,4种突变类型患者的血清HBVDNA、ALT岍差异均无统计学意义(P>0.05).结论 YMDD基序突变是LAM耐药后HBV聚合酶基因突变的主要模式,LAM耐药后患者临床病情轻重可能与HBV聚合酶基因突变类型无关.     

HBV表型耐药方法的建立及临床分离株的表型耐药分析

目的建立HBV表型耐药分析方法 ,体外培养慢性乙型肝炎患者血清HBV分离株并系统分析其对拉米夫定(LAM)的敏感性。方法从1例LAM耐药慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增RT基因,克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选10个克隆进行DNA序列测定,并分析RT区LAM耐药相关的突变位点。用XhoI和NcoI双酶切pGEM-Teasy-RT及pTriEx-HBV(C),构建1.1倍HBV野生株和LAM耐药突变株的重组载体pTriEx-wRT和pTriEx-mRT,转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染60h后加入不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)的LAM,药物连续作用5d后,抽提病毒核心颗粒HBV DNA,通过实时荧光PCR及Southern blotting检测不同药物浓度作用下HBV DNA的复制水平。结果成功建立体外HBV表型耐药分析方法。野生未突变株重组载体pTriEx-wRT转染HepG2细胞后,随着LAM浓度的升高,HBV DNA水平明显下降,而突变株重组载体pTriEx-mRT转染HepG2细胞后,HBV DNA水平无明显下降,IC50值与野生株相比增加了2500倍。结论建立的HBV表型耐药分析方法对监测HBV耐药性具有可行性。     

乙肝病毒相关的慢性肝病患者胰岛素抵抗指数测定的临床意义

目的 探讨胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)在不同临床类型慢性乙型肝炎患者中的变化及其在肝源性糖尿病发生的早期预警中的作用.方法 选取临床确诊的80例慢性乙型肝炎(CHB)患者,66例乙型肝炎肝硬化(LC)患者和30例慢性乙型重型肝炎(CSHB)患者,另外选取30例健康人作为健康对照(HC).所有研究对象(既往无糖尿病史)均通过检测空腹血糖(FPG)及口服葡萄糖耐量试验(OGTT)以排除糖耐量异常及糖尿病,并检测FPG以及空腹胰岛素水平(FINs)以计算HOMA-IR值.结果 从HC、CHB、LC至CSFIB患者,FINS和HOMA-IR均逐渐升高,其中CHB患者(10.58±6.48,2.35±1.55)较HC组患者(8.06±2.14,1.68±1.53)明显升高(P<0.01),而显著低于LC患者(12.73±5.88,2.91±1.41)和CSHB患者(18.30±14.17,4.35±3.17.P<0.05).按照CHB的临床分度,重度CHB患者的FINS与HOMA-IR均显著高于中度CHB患者(P<0.05).FPG在CHB患者与HC组之间以及CHB不同临床分度的患者内部均无明显差异(P>0.05),但LC和CSHB患者的FPG较HC组显著升高(P<0.05).在不同Child-Pugh分级的IX:患者中,Child-C级患者的FPG值要明显高于Child-A级(P<0.01).结论 HOMA-IR可作为预测肝源性糖尿病发生的重要指标.     

瞬时弹性成像联合血清学标志物检测对肝纤维化的诊断效能分析

目的 血清学标志物联合检测对提高瞬时弹性成像技术(FibroScan)对肝纤维化诊断性能的影响.方法 选取慢性HBV感染患者313例,进行常规生化学检测、FibroScan检测及肝活检,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析曲线下面积(AUROC),确定FibroScan、APRI、FIB-4诊断不同程度肝纤维化的界值...