血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其受体在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其受体在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达,为构建药物筛选的在体模型提供依据。方法采用多聚酶链式反应,扩增了长约280bp的斑马鱼血管发生素-1 cDNA部分序列,作为探针,以原位杂交法测定了血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其相应受体flk-1和Tie-2的表达。结果从受精卵胚胎发育第12小时可见血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其相应受体flk-1和Tie-2的表达;在受精卵胚胎发育的第16小时,血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1主要在头部和尾部胚芽表达;第24小时在眼球、视窝、中脑、后脑的腹前侧和肌节中表达,Tie2和F lk-1主要在肌间背部动脉血管、躯干新生血管芽和轴向静脉中表达。结论血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其受体在斑马鱼胚胎发育早期的血管发生过程中可能相互作用,并协调血管发生过程。斑马鱼是研究胚胎发育早期微血管发生和血管发生的极佳动物模型,可用于促血管发生或抑制血管发生药物筛选。     

白藜芦醇对斑马鱼尾鳍再生的促进作用及机制研究

目的研究白藜芦醇促进斑马鱼尾鳍再生的活性及作用机制,并研究其对斑马鱼胚胎发育的影响,为白藜芦醇药效的进一步开发和安全用药提供依据。方法采用斑马鱼(Fli1-GFP)模型,研究白藜芦醇对斑马鱼尾鳍切除后血管和组织再生的影响,用相对荧光定量PCR法检测仔鱼切尾后体内血管内皮生长因子(VEGFA)和受体(VEGFR2)基因的表达量;研究白藜芦醇对斑马鱼胚胎发育的影响,检测其对斑马鱼胚胎自主运动、心率、孵化率的效应。结果白藜芦醇具有血管生成活性,可促进斑马鱼尾鳍再生,能提高仔鱼切尾后体内VEGFA及VEGFR2基因的表达量;白藜芦醇对斑马鱼胚胎发育有一定影响,主要表现为低浓度时促进自主运动和孵化率但高浓度时呈抑制效应,且可降低心率。结论白藜芦醇可促进斑马鱼尾鳍再生,作用机制可能与促进VEGFA和VEGFR2基因表达有关。白藜芦醇对斑马鱼胚胎发育有一定毒性。     

RPS20RNA干扰慢病毒的构建及其对CT26细胞生长的影响

目的 研究脾虚证差异表达基因——核糖体蛋白S20 (RPS20)RNA干扰慢病毒转染对小鼠结肠癌细胞(CT26)细胞指数的影响,验证前期筛选的RNA干扰序列的有效性,为后续在小鼠体内以RNA干扰进行RPS20的功能鉴定提供参考.方法 根据前期筛选的RPS20 RNA干扰有效序列,进行质粒载体的重组,包装RPS20干扰慢病毒并转染CT26细胞,采用xCELLigence细胞动态分析仪实时监测转染后细胞的细胞指数以反映细胞的生长情况.结果 测序图谱和Blast比对结果表明重组慢病毒包装载体构建成功,慢病毒滴度为1.2×105 TU/mL,RNA干扰慢病毒转染后CT26细胞指数的增长受到明显抑制,转染后30 h细胞指数抑制率达到82.24％.结论 前期筛选的RPS20 RNA干扰序列可成功构建包装干扰慢病毒,转染后能有效抑制CT26细胞的生长,可为后续研究提供参考.     

过山枫有效成分南蛇藤素和扁蒴藤素对斑马鱼节间血管生成的抑制作用研究

目的 观察过山枫有效成分南蛇藤素和扁蒴藤素对Fli1-GFP转基因荧光斑马鱼节间血管生成的影响。方法 采用Fli1-GFP转基因荧光斑马鱼胚胎,胚胎发育至6 h后,分别加入不同浓度的南蛇藤素及扁蒴藤素与斑马鱼胚胎共同孵育,待胚胎发育至30 h时,荧光显微镜下观察并计数斑马鱼胚胎节间血管的数量、血管芽数,测量血管长度并计算新生血管长度抑制率。结果 与阴性对照组比较,南蛇藤素与扁蒴藤素干预后,两组斑马鱼胚胎新生血管数量明显减少(P < 0.01),血管芽增多(P < 0.01),新生血管长度抑制率升高(P < 0.01)。结论 南蛇藤素及扁蒴藤素对斑马鱼节间血管生成有显著的抑制作用,这种作用与给药浓度呈正相关,南蛇藤素与扁蒴藤素比较,具有相近的新生血管抑制作用。     

通阳活血方在内皮细胞及斑马鱼模型上促血管新生作用及其机制的研究

目的:评价通阳活血方(GSE)在斑马鱼模型及内皮细胞模型上的促血管新生作用,并探讨其可能的作用机制。方法:采用VEGF受体抑制剂(VRI)诱导斑马鱼背部节间血管丢失和EA.hy926细胞毒性。利用内皮细胞标记绿色荧光的转基因斑马鱼Tg(Fli-1:EGFP),在荧光显微镜下在体观察通阳活血方的促血管新生作用。体外采用EA.hy926内皮细胞模型,用MTT法检测通阳活血益气方抑制VRI的细胞毒性作用。通阳益气活血方促血管新生机制研究则采用Real-time PCR的方法,在体检测斑马鱼体内内皮生长因子受体(VEGFR)的表达情况。结果:在斑马鱼模型上,模型组VRI明显抑制斑马鱼节间血管生成。与模型组相比,GSE处理后能够明显促进斑马鱼节间血管生长,其血管生长指数与模型组相比具有统计学差异(P0.01)。在细胞模型上,模型组VRI对内皮细胞EA.hy926的增殖具有抑制作用,而GSE药物处理后能够明显促进EA.hy926细胞增殖(P0.01)。Real-time PCR结果表明,模型组VRI显著抑制了斑马鱼体内VEGF受体的表达,GSE给药组flt1、kdr、kdrl表达量均明显增高(P0.01)。结论:通阳活血方在内皮细胞模型和斑马鱼模型上均具有血管新生作用,其机制可能与其上调VEGF受体flt1、kdr、kdrl的表达有关。     

斑马鱼作为一种重要的工具进行肝脏疾病研究

随着肝胆相关疾病发病率的增加,深入理解肝病发展过程中分子、细胞和生理因素在中医药临床诊断和治疗中的作用显得尤为重要。合适的动物模型能够帮助针对性的识别相关疾病的可能机制。斑马鱼Danio rerio模型传统上主要用于研究胚胎发育,近些年已经被逐渐的用于肝脏疾病、相关药物筛选和评价等方面的研究。斑马鱼胚胎发育迅速,5日龄幼鱼的消化器官全部成熟。在此阶段内,它们可发展为由发育缺陷或化合物诱导的肝胆疾病。斑马鱼肝脏在细胞组成、功能、信号传导、对损伤的反应以及介导肝脏疾病的细胞过程等方面与人类相似。不仅如此,人类和斑马鱼之间基因、蛋白的高度保守性,使其成为研究肝脏疾病基本机制的一个可替代系统。因此,可以通过基因筛查以鉴定涉及特定疾病过程的新基因,通过化学筛查作用于特定过程的药物。该文介绍了斑马鱼作为模式系统的实验属性,并强调斑马鱼模型在肝脏疾病等方面的,尤其是脂肪肝方面,相关病理机制以及药物筛选、评价的研究进展,以期为未来中医药肝毒性评价提供思路和技术。     

小金胶囊对斑马鱼移植瘤的抗肿瘤作用

目的应用斑马鱼模型研究小金胶囊(麝香、木鳖子、制草乌等)的抗肿瘤作用。方法荧光标记的人乳腺癌细胞(michigan cancer foundation-7,MCF-7)移植入斑马鱼卵黄囊内建立移植瘤模型。小金胶囊以水溶液暴露移植瘤斑马鱼以评价其抗肿瘤作用,用转基因斑马鱼观察其对新生血管形成的抑制作用。吖啶橙染色后,图像分析法评价该药物的体内细胞凋亡诱导作用。结果 26.47、88.24、264.72μg/m L的小金胶囊对斑马鱼MCF-7移植瘤的抑制率分别为31.66%、54.35%、53.77%(P0.01)。小金胶囊在高质量浓度(264.72μg/m L)下能显著抑制血管形成和诱导细胞凋亡,抑制率和诱导率分别为21.74%和28.92%(P0.01)。结论小金胶囊能诱导细胞凋亡,抑制MCF-7移植瘤生长和新血管形成,具有潜在的抗肿瘤作用。     

t-PA基因慢病毒表达载体的构建及其在内皮祖细胞中的表达研究

目的:构建t-PA基因慢病毒表达载体并转染脐血来源的内皮祖细胞,评估其转染后功能变化情况。方法:RT-PCR获得t-PA cDNA,将真核表达质粒pcDNA3.1(+)和t-PA基因片段分别双酶切,构建pc DNA3.1(+)/t-PA质粒。对其进行酶切鉴定和测序,使目的基因连接入载体质粒中,构建成重组慢病毒载体质粒,制备包装病毒质粒转染内皮祖细胞。倒置荧光显微镜下观察转染24h后内皮祖细胞中绿色荧光蛋白的表达情况,RT-qPCR和Western blot检测转染后t-PA基因的表达水平。采用Brdu标记细胞DNA、BCA蛋白定量、MTT分析法检测内皮祖细胞DNA合成能力、总蛋白含量和细胞存活率。结果:成功构建了含有t-PA基因cDNA序列的慢病毒表达载体p Lenti6.3-t-PA,DNA测序结果完全正确,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,内皮祖细胞转染重组慢病毒后t-PA表达水平比未转染组显著增高(P0.01)。t-PA慢病毒表达载体转染内皮祖细胞后,内皮祖细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率均较对照组无明显变化。结论:成功构建t-PA基因慢病毒表达系统,转染内皮祖细胞后对其DNA合成、总蛋白合成、细胞存活率无明显影响。     

稳定表达SAV细胞的建立及其相互作用蛋白的筛选

目的建立能稳定表达SAV(Salrador Homolog)的人胚胎肾细胞HEK293细胞池并从中纯化出SAV相互作用蛋白复合物。方法从人胚胎肾细胞HEK293中提取RNA,RT-PCR扩增得到SAV基因片断,构建表达质粒pBabe-SBP-FLAG-SAV。将pBabe-SBP-FLAG-SAV质粒和病毒包装质粒共同转染HEK293T细胞来产生病毒,收获病毒后感染HEK293细胞。通过嘌呤霉素筛选直至没有细胞死亡并用Western-blot验证表达情况。用链酶亲和素beads从该稳定细胞池中纯化SAV相互作用蛋白并通过银染检测。结果 pBabe-SBP-FLAG-SAV真核表达载体构建成功,包装病毒感染HEK293后通过Western-blot检测可见SAV蛋白的表达,FLAG beads和链酶亲和素beads免疫沉淀进一步证明了该融合蛋白表达的正确性。链酶亲和素纯化出的SAV相互作用蛋白复合物在银染时可见。结论成功构建了pBabe-SBP-FLAG-SAV真核表达载体及稳定表达细胞池,纯化得到SAV相互作用蛋白复合物。为阐明这些蛋白复合体在Hippo信号通路中的作用提供了可靠信息。     

低氧诱导神经元特异性表达bFGF重组腺相关病毒载体构建研究

目的:研究构建低氧诱导神经元特异性表达碱性纤维细胞生长因子(bFGF)重组腺相关病毒载体。方法:以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为治疗靶基因,通过分子克隆手段,构建低氧诱导、神经元特异性表达bFGF的"时空"表达可调控性新型重组腺相关病毒(AAV)载体。结果:将重组质粒5HRE-3NRSE-bFGF的菌液送测序,得到测序结果,并与合成的DNA寡核苷酸序列进行比较,证实与设计序列完全一致。结论:构建、包装重组腺相关病毒载体pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF有效。     

虎杖查耳酮合酶基因RNAi载体的构建及其遗传转化

目的构建虎杖查耳酮合酶(Pc CHS1)基因的RNA干涉(RNAi)表达载体,获得Pc CHS1表达下调的转基因虎杖植株。方法根据Gen Bank中已知的Pc CHS1基因序列(EF090604),设计相应引物,克隆Pc CHS1基因核心保守序列。以Pc CHS1基因为靶基因,将长度574 bp保守序列片段通过正、反2个方向插入表达载体p YLRNAi中,构建RNAi表达载体p YLRNAi-Pc CHS1。通过根癌农杆菌介导法将其导入虎杖茎尖组织。对获得的转基因植株,利用Northern blotting检测Pc CHS1基因表达水平,并应用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇苷的量。结果成功构建Pc CHS1基因RNA干涉表达载体,获得了5株转Pc CHS1基因干涉载体的阳性植株。转基因虎杖Pc CHS1基因表达水平显著下调,并且转基因植株中白藜芦醇苷量均得到显著提高,其中最高量是对照植株的3.8倍(P0.05)。结论成功获得了干涉Pc CHS1基因表达下调的转化植株,抑制Pc CHS1基因的表达显著增加了转基因虎杖中白藜芦醇苷的量,为有效利用该基因提高虎杖白藜芦醇苷量奠定基础。     

ATO，ATRA／G-CSF联合使用加速RARα降解诱导NB4细胞末端分化

目的：探讨三氧化二砷（ATO）、全反式维甲酸（ATRA）及粒细胞集落刺激因子（G-CSF）（A／G）联合使用,诱导NB4细胞末端分化的分子机理。方法：台盼蓝染色记录细胞生长,吉姆萨染色观察细胞的形态学变化,流式细胞仪分析确定细胞分化分子标志及凋亡,Westernblot观察RAR仪蛋白的表达。结果：NB4细胞经过ATO4-A／G处理,出现形态学末端分化特征和免疫表型的成熟。Westernblot结果显示,RAR仪基因是ATO特定的靶向目标。结论：ATO联合ATRA／G—CSF能够诱导NB4细胞末端分化,其机理与调节RARa的表达有关。     

茜草蒽醌诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其分子机制的研究

目的:探讨茜草提取物蒽醌单体对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用,诱导凋亡作用及对凋亡相关基因bcl-2表达的影响,为肝癌的基因治疗提供有效靶点。方法:采用MTT法检测生长的抑制作用;以形态学,DNA凝胶电泳,流式细胞仪单染、双染检测细胞凋亡;以RT-PCR来分析蒽醌对bcl-2 mRNA的影响。结果:蒽醌能抑制肝癌细胞的生长;蒽醌处理肝癌细胞后,倒置显微镜和光镜下可见典型的凋亡细胞;DNA琼脂糖凝胶电泳显示出典型的细胞凋亡梯形带,PI单染表明细胞周期的G1期前有异常二倍体细胞的凋亡峰,并将细胞周期阻滞在G1期,Annexin V-FITC/PI定量检测进一步证实了蒽醌诱导肝癌细胞凋亡的作用;RT-PCR检测表明蒽醌可使bcl-2 mRNA表达水平下降。结论:蒽醌能显著抑制肝癌细胞的生长,并诱导肝癌细胞凋亡,其分子机制可能与下调bcl-2基因的表达有关。     

三叶青扩展蛋白家族基因全长cDNA的克隆及其生物信息学和表达分析

目的克隆三叶青Tetrastigma hemsleyanum的扩展蛋白家族基因,对其进行器官表达分析,并初步探讨其功能。方法根据Gen Bank中登录的扩展蛋白基因保守区域序列设计1对简并引物,以三叶青球形块根c DNA为模板进行RT-PCR扩增,再结合RACE技术,获得三叶青扩展蛋白基因全长c DNA序列,命名为Th-exp。采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析Th-exp基因在不同器官中的表达情况。结果克隆获得扩展蛋白家族基因,共782 bp,其中包含630 bp开放阅读框,编码209个氨基酸(Gen Bank登陆号KP693606)。Th-exp编码的蛋白质具有典型的扩展蛋白结构特征,N端含有8个半胱氨酸的结构域,C端含有4个保守的色氨酸结构域,中间含有组氨酸功能域。Blast分析显示,Th-exp与葡萄、醉蝶花中扩展蛋白基因具有相似性。半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,Th-exp在三叶青叶、茎、普通细根和球形块根中均有表达,但球形块根中表达强于其他器官。结论克隆得到三叶青扩展蛋白家族基因Th-exp全长c DNA,初步预测其参与了三叶青块根的发育过程。     

熟地黄有效成分5-HMF对皮质酮损伤型海马神经元GCR、BDNF、SGK表达的影响

目的:观察熟地黄中有效成分5-羟甲基糠醛(5-HMF)对高浓度皮质酮(CORT)致海马神经元损伤及学习记忆相关蛋白学习记忆相关蛋白(GCR)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)蛋白表达的影响。方法:用24h新生大鼠原代培养海马神经细胞。第8天细胞用药处理,将细胞分为3组:正常对照组、模型组及5-HMF组。24h后,通过MTT法测定细胞活性,生化方法检测衰老特异性指标β-半乳糖苷酶活性,Western Blot检测学习记忆相关蛋白GCR、BDNF、SGK的基因表达。结果:与正常组相比,模型组细胞活力显著下降,β-半乳糖苷酶活性显著升高,GCR、BDNF、SGK蛋白表达显著性降低;0.5mg/L的5-HMF明显提高细胞活力,降低β-半乳糖苷酶活性,提高模型细胞GCR、BDNF、SGK基因表达(P0.05,P0.01)。结论:0.5mg/L 5-HMF可以保护大鼠海马神经细胞免遭高浓度皮质酮的损伤,通过调节GCR、BDNF、SGK的基因表达,可能在延缓学习记忆功能退化中发挥作用。     

天花粉蛋白对子宫颈癌Hela细胞Survivin基因的影响

目的:研究天花粉蛋白(TCS)对子宫颈癌Hela细胞Survivin基因表达的影响,以探讨TCS诱导Hela细胞凋亡的机制。方法:MTT法检测TCS对Hela细胞增殖的影响,倒置显微镜观察细胞形态;RT-PCR和Western blot分析TCS对Hela细胞Survivin基因表达的影响;流式细胞仪分析TCS对Hela细胞周期的影响。结果:①TCS显著性抑制Hela细胞增殖;②TCS处理后Hela细胞Survivin mRNA水平无明显改变,但蛋白表达水平显著降低;③TCS降低Hela细胞周期中G2/M期细胞比率,但增加S期细胞的数量。结论:通过下调凋亡抑制因子Survivin的表达而诱发Hela细胞凋亡,可能是TCS抑制Hela细胞增殖的分子机制。     

益气健脾中药对血管平滑肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

目的：探讨益气健脾中药血清体外诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用及其分子机制。方法：采用缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nicked labeling,TUNEL)分析、透射电镜、流式细胞仪分析、DNA电泳分析检测细胞凋亡；应用Northern印迹检测bcl-2、c-myc和p53基因表达活性。结果：经中药血清处理的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC)，可出现典型的凋亡特征，DNA电泳呈梯状图谱；流式细胞仪分析显示G0／G1期细胞阻滞现象，亚二倍体凋亡细胞增多，出现典型的凋亡峰，细胞凋亡率与中药血清浓度具有量效关系。杂交结果提示，30％中药血清可抑制抗凋亡基因bcl-2的表达，上调促凋亡基因c-myc和p3 mRNA水平。结论：益气健脾中药通过影响凋亡相关基因bcl-2、c-myc和p53的表达活性而诱导VSMC凋亡。     

三七总皂甙对IL-1α诱导大鼠肾小管细胞转分化的影响

目的 研究三七总皂甙(PNS)能否通过阻断IL-1α诱导的肾小管上皮细胞转分化及减少细胞外基质分泌,防治肾间质纤维化的发生。方法体外培养正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E),应用倒置相差显微镜及扫描电镜观察NRK52E细胞形态学变化;流式细胞技术及免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;ELISA法定量检测细胞上清液中纤维连接蛋白(FN)水平。结果 IL-1α可诱导肾小管上皮肌纤维母细胞转分化(TEMT),细胞肥大、拉长呈梭形,α-SMA表达明显增强,FN分泌增加(P<0．05)。加入不同浓度PNS后,细胞形态接近正常肾小管上皮细胞形态,α-SMA表达、FN分泌均较IL-1α诱导组明显抑制(P<0．05)。这些作用呈剂量依赖性抑制(P<0．05)。单独加入不同剂量PNS肾小管细胞无明显变化。结论 IL-1α可诱导肾小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化,并可促进细胞外基质成分FN的沉积;PNS能抑制IL-1α诱导的NRK52E细胞转分化及细胞外基质分泌,可作为防治肾间质纤维化及终末期肾脏疾病的新药物。     

金属硫蛋白2基因在红花中表达的初步研究

目的 获得转金属硫蛋白2(metallothionein 2,MT2)红花植株,为MT药用蛋白的生产奠定基础。方法采用Nco I/HindⅢ酶切pEASY-oleosin-MT获得oleosin-MT融合基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT,进行PCR和双酶切鉴定。采用冻融法将重组质粒pOP-oleosin-MT转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,对转MT基因红花植株进行PCR检测及Southern blotting检测。结果成功构建了MT基因的植物油体表达载体pOP-oleosin-MT,获得了3株PCR检测呈阳性的转MT基因红花植株。结论建立了完善的红花再生体系,获得了转MT基因的红花植株。     

珍珠梅提取物抑制肝癌HepG-2细胞增殖的实验研究

目的:观察珍珠梅提取物对肝癌HepG-2细胞增殖的影响,探讨其作用机制。方法:采用MTT比色法观察珍珠梅提取物抑制肝癌HepG-2细胞增殖;采用流式细胞仪检测其对HepG-2细胞周期分布的影响,同时结合倒置显微镜、HE染色、透射电镜及免疫细胞化学方法检测凋亡相关基因bcl-2、p53的蛋白表达,观察其诱导肝癌HepG-2细胞凋亡的作用。结果:珍珠梅提取物可抑制肝癌HepG-2细胞增殖,其作用具有时间和浓度依赖性;珍珠梅提取物可诱导细胞凋亡;同时改变细胞周期分布,多数细胞阻滞于G2/M期,与对照组比较,细胞凋亡率差异有显著性(P<0.01);用药前后凋亡相关基因bcl-2、p53蛋白表达均有显著性改变(P<0.01)。结论:珍珠梅提取物可诱导肝癌HepG-2细胞凋亡,改变细胞周期分布,从而抑制细胞增殖。