基因免疫使用的腺相关病毒载体

基因免疫开创了疫苗研究的新纪元,这种免疫方法提供了稳定而且长期不断的蛋白抗原来源.DNA疫苗制备简单,没有明显的毒性或宿主免疫力并能有效诱导体液和细胞免疫.使用病毒载体的DNA疫苗在一些临床前实验模型中具有较高的基因转移效率和诱导保护性与治疗性免疫作用.本文论述了腺相关病毒在疫苗研制中的应用潜力.     

基于腺相关病毒载体的癌症免疫治疗研究进展

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体因其出色的基因传递能力和安全性已经成为基因治疗领域的重要工具。近年来,将AAV载体用于癌症免疫治疗已成为一个新的热点研究方向,主要包括以下几个方面：一是基于AAV载体的新型肿瘤疫苗的开发,通过AAV载体表达肿瘤相关抗原,激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应;二是AAV载体介导的免疫细胞修饰,通过AAV载体对免疫细胞进行编辑并用于过继性细胞治疗;三是AAV载体介导的细胞因子的传递,通过AAV载体持续表达抑制肿瘤生长的细胞因子,调节肿瘤微环境和免疫平衡。这些策略均展现出了良好的应用前景,但在实际应用中也存在着一些挑战,如免疫消除、转导效率低等问题。文章将对近年来基于AAV载体的肿瘤免疫治疗的研究进展进行综述,并总结研究中存在的挑战及未来发展方向,以期对这一拥有广泛前景的领域的研究提供参考。     

腺相关病毒载体介导的肿瘤基因治疗研究进展

基因治疗有望成为肿瘤治疗的有效手段,用于携带外源基因的载体在肿瘤基因治疗中发挥了重要作用.其中腺相关病毒(AAV)载体具有安全性高、长效表达、宿主范围广泛等优点,在基因治疗中得到越来越广泛的应用.本文重点综述AAV的生物特点、载体发展及其在肿瘤基因治疗中的应用.     

重组腺相关病毒载体在肺癌治疗中的应用

重组腺相关病毒（recombination Adeno-associated virus,rAAV）突出的特点使其成为基因治疗载体中的佼佼者,本文综述了rAAV基因药物在肺癌治疗中取得的进展并对其未来发展趋势进行了探讨。     

降低重组腺相关病毒载体中空病毒颗粒的对策

可稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒(rAAV)载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体中具潜在致病危害的空病毒颗粒,使产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。以下总结了空病毒颗粒形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

重组腺相关病毒载体的免疫性研究及其解决策略

重组腺相关病毒载体（rAAV）作为一种高靶向性和良好安全性的病毒载体,在基因治疗的临床前和临床研究中具有极广泛的应用前景。目前在全球范围内已有71项临床研究在进行之中或已经完成。其中有相当部分在血友病、视网膜疾病、帕金森、囊性纤维化以及癌症等疾病的治疗中都取得了显著疗效。随着临床上的成功,人们对rAAV所引起的免疫性及其应对策略也进行了更为广泛而深入的研究。本文将就rAAV的外壳蛋白以及目的基因产物所引起的免疫性进行综合探讨,并结合我们的部分研究工作从改变外壳蛋白、给药方式以及消除内源性外壳蛋白的表达等方面对消除外壳蛋白所引起的免疫性的一些策略加以详述。     

腺相关病毒载体介导的VEGF121基因的构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达

目的 研究腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子基因(AAV-VEGF121)的体外促血管内皮细胞生长作用.方法 RT-PCR法获取人VEGF121基因,克隆入pAAV-MCS载体中,构建成pAAV-VEGF121(处理组),以空白载体克隆入pAAV-MCS病毒(对照组);两组分别在AAV-293细胞中包装成pAAV-VEGF121病毒颗粒和空白病毒颗粒.相同条件下,两组分别感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),半定量RT-PCR检测细胞内VEGF121基因mRNA的表达;CCK-8法测取OD450nm值,绘制细胞增殖曲线;电子显微镜观察细胞超微结构的改变.结果 成功构建AAV-VEGF121;半定量RT-PCR显示处理组细胞内VEGF121的mRNA表达水平高于对照组(P＜0.01);细胞增殖曲线显示处理组细胞增殖能力明显高于对照组;透射电镜显示处理组细胞内与蛋白质合成有关的细胞器增生明显活跃.结论 AAV-VEGF121基因对血管内皮细胞的生成具有促进作用.     

DNA疫苗的载体及其主要结构特征

ＤＮＡ免疫为疫苗的研究开创了新的领域,而基因疫苗发展的一个主要目标就是控制目的基因在体内的表达水平以达到有效的免疫效果。对载体进行适当修饰来调节目的基因的表达及其表达产物的免疫原性对于改善ＤＮＡ疫苗的免疫效果非常重要质粒为基因免疫的常用载体。本文就与载全设计有关的主要结构成分以及可插入质粒以增强免疫辅佐性的免疫刺激序列（ＩＳＳ）及其对免疫系统的激活作用进行概述。     

艾滋病疫苗替代品腺相关病毒介导抗体基因的研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)载体介导的抗体基因治疗药物,可为宿主直接提供中和抗体而使其免受艾滋病毒感染,有望成为艾滋病预防及治疗疫苗的替代品。综述人免疫缺陷病毒(HIV)专属性广谱中和抗体发现过程的文献资料,介绍了rAAV介导的抗HIV抗体基因治疗的试验结果,并对rAAV在艾滋病预防及治疗的研究进展作了分析。     

携带人S100A1基因的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的:构建携带有人S100A1基因的重组腺相关病毒(Adeno-associated viru,AAV)载体,并对其进行鉴定.方法:用BamH I和EcoRI 将目的基因pUC57-Simple-S100A1和腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1行双酶切,回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化感受态DH5a,获得重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1.酶切及测序鉴定后,将pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293,包装重组腺相关病毒rAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1.收获重组病毒后感染HEK293细胞,荧光计数法测定病毒滴度,病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1经双酶切和测序鉴定正确;荧光显微镜下观察转染AAV-293细胞72 h后,病毒包装效率达95％～100％,荧光计数法测定病毒感染滴度达(2～3)×107 TU/mL;提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因S100A1片段.结论:成功构建携带有人S100A1的重组腺相关病毒载体rAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1,收获的病毒具有较高滴度,为今后利用腺相关病毒载体进行S100A1基因转染治疗慢性心力衰竭的体外及体内研究提供了实验基础.     

大鼠星状细胞激活相关蛋白基因的克隆及其重组腺相关病毒载体的构建

克隆大鼠星状细胞激活相关蛋白(Stellate Cell Activation-associated Protein,STAP)基因,构建其重组腺相关病毒载体(rAAV-STAP),为进一步研究STAP基因功能提供有效工具。用RT-PCR法从大鼠肝组织中扩增出大鼠STAP基因,将STAP cDNA插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pAM/CAG中,构建重组质粒pAM/CAG-STAP。以磷酸钙共转染法将pAM/CAG-STAP及辅助质粒pAd/H22转染293细胞,经293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺相关病毒rAAV-STAP。ELISA法测定病毒滴度,Western blot法检测重组病毒感染293细胞后STAP的表达情况。实验结果表明,RT-PCR法从大鼠肝组织中扩增出573bp cDNA,测序证实为大鼠STAP基因。Western blot法证实rAAV-STAP感染293细胞后可在细胞内表达STAP。     

腺相关病毒载体纯化技术的研究进展

目的:综述腺相关病毒(AAV)载体的分离纯化方法,为AAV的规模化制备提供参考。方法:以AAVPurityChromatography腺相关病毒纯化等为关键词,组合检索2000年1月-2015年8月在Pub Med、Web of Science、Elsevier、中国知网、维普等数据库中有关AAV分离纯化的文献,选择有代表性的文献进行归纳、总结,分别从AAV纯化的超速离心法、液相色谱法、化学试剂法和超滤法等4个方面进行综述。结果:共查阅到相关文献260余篇,其中有效文献48篇。液相色谱法纯化AAV表现优异,亲和色谱、离子交换色谱等色谱技术已经广泛用于AAV1、2、4、5、6、8、9等不同血清型载体的分离纯化,甚至较难分离的AAV的空壳载体也可以实现分离。但是每种血清型载体的理化性质不尽相同,很难用同一种方法纯化所有载体。结论:液相色谱法在规模化纯化AAV载体具备良好优势,但是应该根据不同血清型载体理化特征建立对应的纯化工艺。     

腺相关病毒载体与基因治疗的研究进展

腺相关病毒(AAV)是基因治疗中最有希望的载体之一,它具有非致病性、对宿主免疫原性弱及广泛的细胞和组织亲嗜性等优点.本文着重探讨了AAV的血清分型与高滴度表达抑制转录因子的重组AAV的制备,并综述了AAV在基因治疗糖尿病及心血管病中的最新研究进展.     

重组VEGF165基因腺相关病毒的包装和鉴定

目的包装重组VEGF165基因的无致病性腺相关病毒,以其作为基因载体感染HUVEC细胞并检测其表达,并在体外检测病毒生物学活性。方法从含有VEGF165基因的pET-32a（＋）-VEGF165原核表达载体中扩增出VEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-VEGF165。将此质粒和对照质粒pAAV-GFP分别与腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper用钙-磷共转法转染HEK293细胞,通过同源重组分别产生rAAV-VEGF165和rAAV-GFP重组腺相关病毒。通过real-timePCR法测定病毒滴度后,转染HUVEC细胞并检测其表达,并通过感染HUVEC来检测其促增殖作用。结果扩增出的VEGF165片段成功构建至重组骨架质粒中,pAAV-VEGF165经双酶切和测序鉴定正确。病毒包装效率达90%以上,收获纯化rAAV-VEGF165病毒滴度达6.0×1010pfu/mL。重组腺病毒rAAV-VEGF165能够感染HUVEC细胞并得到显著性表达;与未转染组和GFP组相比,能够显著促进HUVEC细胞的增殖。结论我们成功包装了重组腺相关病毒rAAV-VEGF165,它能够感染HUVEC细胞并高表达VEGF165蛋白,并具有促增殖作用,这为进一步开展VEGF165基因的基因靶向治疗奠定了基础。     

基因重组hVEGF165腺相关病毒载体的包装和鉴定

目的:采用rAAV Helper free System构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒,并初步鉴定其感染情况。方法:采用AAV-Helper free system包装系,构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒载体质粒,应用电穿孔方法质粒共转染HEK293细胞,分离纯化后获得rAAV-hVEGF165和rAAV-EGFP,AVSachTMELISA法测定rAAV颗粒滴度,并鉴定其对HEK293细胞的感染情况。结果:包装纯化后获得病毒滴度可达到2×1011,电镜观察病毒颗粒均匀,病毒大小20～25nm,呈多面体形态。结论:成功包装hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒。     

一种基因递送的载体——人工病毒[英]

一种具有病毒样功能的人工病毒作为基因递送的载体用于基因治疗的研究正在进行中。虽然该技术尚处于实验室研究阶段，但有可能对将来的基因治疗产生巨大影响。全世界已进行过1000多次基因治疗临床试验，但成功率很低，而且，目前尚没有一个基因治疗的产品通过FDA批准。造成这种现象的很重要的一个原因是现有的基因治疗载体很难将目的DNA递送进靶细胞并在胞核内持续表达，即现有的技术如质粒等细胞的转染率很低。     

诱导型一氧化氮合酶反义RNA重组腙相关病毒载体的构建

目的应用分子克隆技术构建携带诱导型一氧化氮合酶(iNOS)反义基因片断的重组腺病毒载体(rAAV-AsiNOS)。方法应用RT-PCR技术扩增iNOS目的基因片断,EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶分别双酶切pAAV-MCS质粒和iNOS基因,经过胶回收和纯化后,住T4连接酶作用下,构建rAAV-AsiNOS重组质粒,并转化到感受态细菌XL-10中,进行鉴定和测序,293细胞病毒包装,重组腺相关病毒载体大量扩增,滴度和感染率的测定以及浓缩和纯化。结果从SD大鼠脑缺血区域中扩增的iNOS特异性片段大小分别为361bp;经双酶切和连接成重组质粒rAAV-AsiNOS;PCR鉴定结果显示重组质粒rAAV-AsnNOS目的基因产物特异性片段大小为593bp;基因测序结果显示iNOS基因片段分别反向克隆到pAAV的MCS,成功地构建携带反义iNOS基因的重组质粒rAAV-AsiNOS;经测算病毒原液的滴度为(6～12)×107个/ml,对PC12细胞的感染率约为70%;分离浓缩和纯化重组腺相关病毒载体,获得较高的病毒滴度,均约2×1010个病毒颗粒/ml,去除腺病毒等影响因素。结论成功构建携带iNOS反义基因的腺相关病毒载体,测序证实iNOS基因片断分别反向克隆到的腺相关病毒载体上;证实重组腺相关载体能够传染PC12细胞,转染率为70%。     

一种基因治疗和基因免疫表达载体的构建

遗传物质DNA的体内导入为疾病的治疗开辟了一个新的方法，即基因治疗或基因免疫。百为了实现基因在体内的表达，一个高效，安全的真核表达是必不可少的，本研究构建了一个可用于基因治疗或基因免疫的真核表达载体pNCMV，此载体以一个来自巨细胞病毒的立即早期基因启动子作用为调控系列，并且分别引入了用于在原核和真核系统复制的，以及便于筛选的诸多元件，为了验证此载体的有效性，在CMV启动子下游插入了一段编码HBV表面抗原的基因序列，得到一个表达载体PNCMVS2-S，体外转染试验表明了此载体的能够产生具有免疫原性的表面抗原颗粒。     

基因转移载体的研究进展

目的:介绍基因转移载体的研究进展,为其深入研究提供参考.方法:对近年来有代表性的文献进行分析、归纳.结果:介绍了病毒载体和非病毒载体的主要优缺点、研究方向及存在的障碍.结论:病毒载体虽转染率较高、表达时间长,但其安全性令人担比.非病毒载体的转染率还不够高,有效表达时间短,其毒副反应近来也受到关注;为了进一步提高其转染率和表达持续时间,还须深入研究外源DNA进入靶细胞核的细胞和分子机制.