马铃薯疮痂病的实时定量PCR检测方法

应用实时定量PCR技术对马铃薯疮痂病进行检测,在Nec1、TxtAB致病基因上进行引物探针的设计,在Nec1基因上筛选获得最佳探针引物。本方法重复性好,特异性强,灵敏度高,可实现准确定量。     

新疆4种林木腐烂病菌PCR快速检测技术研究

[目的]建立新疆林木腐烂病菌的快速PCR检测方法,为新疆林木腐烂病的早期测报和防治提供技术依据.[方法]针对新疆林木腐烂病菌主要种苹果黑腐皮壳(Valsa mali,污黑腐皮壳(Valsa.sordida),Leucostoma niveu和Valsa.malicola的rDNA-ITS特异性区段设计属专化型引物和种特异性引物.[结果]属专化型引物VF/VR可以从腐烂病菌中扩增一条424 bp的条带,检测灵敏度为10 pg/mL;设计的4对种特异性引物分别可对4种腐烂病菌V.mali,V.sordida,L.nivecum,V.malicola检测到263 bp、423 bp、307 bp、308bp的条带,检测灵敏度均为10 pg/mL.[结论]采用腐烂病菌Valsa的rDNA-ITS特异性区段设计的引物及PCR方法,可用于新疆林木腐烂病的快速分子检测.     

利用Real-Time PCR从无症种薯上快速检测马铃薯环腐病菌

马铃薯环腐病是一种典型的维管束病害,病原菌为密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavibacter michiganensesubsp.sepedonicum,Cms),发病块茎切开可见维管束变为乳黄色至黑褐色,皮层内表现环形或弧形坏死部。贮藏后块茎芽眼变黑干枯或外表爆裂,播种后不出芽或出芽后枯死或形成病株。病株的根、茎部维管束常变褐,病蔓有时溢出白色菌脓。该菌在种薯中越冬,成为翌年初侵染源。病菌主要通过种薯远距离传播。由于近几年我国马铃薯产业的快速发展,该病害危害越来越严重,成为种薯生产质量控制的关键点。传统方法是通过症状观察、病原菌分离、染色进…     

几种杀菌剂对马铃薯疮痂病菌的室内毒力

采用纸碟法进行室内毒力测定,比较了12种（商品名）杀菌剂对马铃薯疮痂病菌的抑制效果。其中5种杀菌剂有一定效果,25%比佳可湿性粉剂效果最好,其次是53.8%氢氧化铜干悬浮剂（可杀得2000）,15%细菌先锋可湿性粉剂、72%农用链霉素可溶性粉剂、30%蓝金可湿性粉剂抑制效果较差。通过显微观察被杀菌剂抑制的马铃薯疮痂病菌形态变化发现,25%比佳可湿性粉剂能使病原菌孢子变形,可杀得2000使病原菌气生菌丝断裂,扭曲变形。     

马铃薯疮痂病菌(Streptomyces scabies)的血清学检测

以马铃薯疮痂病菌RB5(Streptomyces scabies)的菌丝-孢子为抗原免疫家兔,制备了抗血清AsRB5,并采用琼脂双扩散和酶联免疫吸附试验对抗血清进行特异性测定,结果表明,供试的10 株马铃薯疮痂病菌,1 株玫瑰黄链霉菌和1株玫瑰暗黄链霉菌与AsRB5 反应为阳性,其他15 株疮痂链霉菌与AsRB5 反应为阴性,作为对照的棉花黄萎病菌、立枯病菌、炭疽病菌与AsRB5 反应为阴性。以上结果表明,使用抗血清AsRB5 检测马铃薯疮痂病菌,基本上可以将其鉴定到种的水平上。但不能对同种内菌株进一步区分或进行多样性评价,并且这种鉴定与其地理来源及寄主无关。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌

将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。     

马铃薯疮痂病菌分离鉴定与抗病诱导剂对马铃薯疮痂病防治效果研究

从哈尔滨马铃薯产区分离疮痂病菌,采用小薯片法测定分离菌株致病性,通过形态观察、生物学特性和16S rDNA基因序列分析鉴定疮痂病菌;利用纸碟法分别测定抗病诱导剂草酸(OA)、水杨酸(SA)、β-氨基丁酸(BABA)、苯并噻二唑(BTH)和茉莉酸甲酯(MJ)对马铃薯疮痂病菌离体生长影响,并通过田间试验测定该5种抗病诱导剂...     

马铃薯疮痂病菌毒素对萝卜幼苗生长的影响

为探求马铃薯疮痂病菌的致病机制,本研究通过乙酸乙酯萃取、薄层层析等技术提取马铃薯疮痂病菌致病毒素,用其处理萝卜幼苗后,观察萝卜幼苗组织形态变化.结果表明:2.20、7.49 mg/mL毒素处理下萝卜幼苗茎、根生长受到明显抑制,2.20、7.49 mg/mL毒素处理对萝卜茎的生长抑制率分别为59.26％、81.64％,对萝卜根的生长抑制率分别为91.64％、100％；显微观察发现,疮痂毒素处理后萝卜幼苗根、茎表皮细胞形态发生改变,且随着毒素浓度的增大,茎表皮细胞长度逐渐减小,宽度逐渐增大；萝卜幼苗叶片经毒素处理3d后出现褐色小点,并出现不同程度腐烂,叶表皮肾形保卫细胞变褐死亡.     

云南马铃薯青枯病菌的PCR检测

利用针对马铃薯青枯病菌hrp基因族DNA序列设计合成特异性寡核苷酸引物（引物1：5‘GAAGAGGAACGACGGAAAGC-3‘和引物2：5‘CGAACAGCCCACAGACAAGA-3‘）,进行马铃薯青枯病菌PCR特异性扩增试验。该试验合成的引物能从马铃薯青枯病菌总基因组的DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增青枯病菌hrp基因区段1993bp的分子片段。该试验结果为马铃薯青枯病菌的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术的方法。     

中国马铃薯疮痂病菌生物学特性分析

【目的】对来自中国不同地区的30株马铃薯疮痂病菌进行了生物学特性分析。【方法】通过扫描电镜观察菌株的形态学特征,同时测试菌株的生理生化及生长限制因子等指标,利用SPSS软件将结果与11株链霉菌标准菌株进行聚类分析。【结果】30个测试菌株中包括Streptomyces scabies种群10株,S.bobili种群7株,S.turgidiscabies种群1株,S.galilaeus种群6株,S.diastatochromogenes种群2株,S.setonii种群1株,S.enissocaesilis种群3株。【结论】由此可见,中国马铃薯疮痂病菌的组成具有明显多样性,其中S.galilaeus,S.bobili和S.enissocaesilis等种群为新发现的马铃薯疮痂病病原菌。     

PCR法快速检测扩张青霉

 【目的】研究棒曲霉素扩张青霉菌（Penicillium expansum）的快速和特异性PCR检测方法。【方法】通过P.expansum的纯菌平板和液体培养以及纯菌接种于苹果、苹果果肉和苹果汁,用Cenis改良方法提取DNA,以基于isoepoxydon dehydrogenase和polygatacturonase编码基因的两对引物扩增P.expansum DNA,建立特异和快速的检测P.expansum的方法。【结果】基于polygatacturonase基因的引物具有很强的特异性,只有目标DNA片段被扩增,而基于isoepoxydon dehydrogenase基因的引物扩增特异性较差。纯培养可以检测到5×10-6 μｇDNA/每反应体系,整个检测时间约为5 h,比传统培养法（4～6 d）时间大大缩短。苹果、苹果果肉和果汁接种纯P.expansum后所提DNA都得到了很好的扩增,具有很高的特异性,不受苹果样品DNA的干扰。【结论】本研究建立的P.expansum的PCR检测方法特异、快速、灵敏,可用于商品果汁和苹果汁工业化生产中P.expansum的快速检测和质量控制,也可用于工艺过程对P.expansum污染的快速溯源。     

食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR（multiplex　PCR）条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法。通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明：该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增茵4～8h其最低检出限可达1cfu／mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域。     

旱稻孢囊线虫的快速分子检测

根据旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)和常见孢囊线虫的ITS序列比对分析,设计1对旱稻孢囊线虫特异性引物He–F/He–R,特异性片段长度为281 bp。运用该特异性引物及建立的DNA提取方法和PCR体系,可特异性检测旱稻孢囊线虫单条2龄幼虫,可以从混合有1条旱稻孢囊线虫的0.1 g水稻根组织中特异性检测出目的DNA片段。特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合,运用一步双重PCR检测方法可快速鉴定单孢囊,也可从初始分离的田间土壤总线虫样品中直接检测出旱稻孢囊线虫。     

食源性病原菌检测方法研究进展

食品中的病原微生物是影响食品安全的主要因素之一,传统检测食源性病原菌的方法繁琐复杂、周期较长,随着分子生物学技术和微电子技术等的发展,快速、简便、特异的检测方法成为研究目标。介绍并分析了几种检测食源性病原菌的方法及其特点,并就其发展历程和应用进行阐述。     

应用双倍PCR技术快速检测大豆胞囊线虫

描述了一种基于双倍PCR技术，用种特异性引物快速鉴定大一啼胞囊线虫方法。应用两组引物扩增胞囊线虫的rDNA。第一组引物含有2个通用引物D3A和D3B，用于扩增大亚基核糖体基因（28S rDNAgene）的D3扩展区；第二组引物包括大豆胞囊线虫特异性引物GlyF1和一个通用引物rDNA2，用于扩增ITS2区的片断和部分28S基因，用此双倍PCR扩增技术检测了来自中国、俄罗斯、美国和巴西的53个大豆胞囊线虫群体，结果表明，用两组引物进行双倍PCR扩增，所有53个大豆胞囊线虫群体都产生两个明显的片断（181bp and 345 bp），其中181bp片断是SCN特异性引物GlyF1和rDNA2扩增出大豆胞囊线虫中特异性片断，在所测试的其它胞囊线虫群体，仅仅扩增出345bp的片断，而不能扩增出大豆胞囊线虫的特异性片断，用该项技术能从大豆胞囊经一虫的胞囊或单头二龄幼虫的微量DNA中，扩增出大豆胞囊线虫的特异性片断，该技术的敏感性达到单条二龄幼虫的水平。     

三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测

为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证.结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增.人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定.本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种快速、简便、可靠的方法,具有重要的理论意义及实践意义.     

基于PCR法快速检测扩展青霉

对PCR快速检测扩展青霉的方法进行了研究.重点考察了退火温度对检测结果的影响,评价了该方法的灵敏度,并考察了该法在苹果样晶检测中的应用效果.结果表明,退火温度为51～61℃,扩展青霉3.5425 DNA扩增效果良好,纯菌培养所得菌体的DNA质量浓度的检测限为2.9×10-3μg/mL,菌液的检测限低于15 cfu/mL,苹果样品对菌体DNA检测结果无影响.     

从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法

 【目的】建立直接从多种线虫混合样品以及香蕉和红掌根组织中检测鉴定香蕉穿孔线虫的PCR方法。【方法】使用Primer Premier 5.0在香蕉穿孔线虫的ITS区设计1对特异性引物,运用PCR技术对目的线虫DNA进行特异性检测。【结果】通过对17种24个种群线虫的检测表明,所设计的引物只能从香蕉穿孔线虫种群中特异扩增出rDNA-ITS片段,产物大小为518 bp。利用该特异引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系,可以直接从香蕉穿孔线虫与短体线虫、螺旋线虫、肾状线虫、根结线虫、茎线虫、矮化线虫、纽带线虫、丝尾垫刃线虫、滑刃线虫和小杆线虫混合样品中特异扩增出目的线虫的rDNA-ITS片段,并可以分别从混合有不少于3条香蕉穿孔线虫的2 cm香蕉或红掌根组织（约0.1 g）中特异检测出目的线虫的DNA片段。【结论】本研究设计的特异性引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系可直接从多种线虫混合的样品以及香蕉和红掌根组织中快速检测鉴定出香蕉穿孔线虫。     

中国马铃薯疮痂病病原菌16S rDNA的遗传多样性分析

 【目的】利用16S rDNA序列对来自中国8个省（区）的34株马铃薯疮痂病菌和15株参比菌株进行系统发育分析。【方法】采用链霉菌通用引物对34株测试菌株的基因组进行16S rDNA序列扩增,测序后在GenBank中进行BLASTn比对,选取同源性较高的菌株构建系统发育树。【结果】34个测试菌株均为链霉菌属,其中Streptomyces scabies 12株、S. galilaeus 8株、S. bobili 6株、S. turgidiscabies 1株、S. acidiscabies 1株、S. diastatochromogenes 2株、S. setonii 1株、S. enissocaesilis 3株。其中S. galilaeus、S. bobili和S. enissocaesilis等种均为新发现的疮痂病病原。对各菌株的分布分析发现,山东省的疮痂病菌有4种,内蒙古自治区和陕西省有3种,四川省、河北省和山西省均有2种,黑龙江省为1种。【结论】中国马铃薯疮痂病菌存在明显的遗传多样性,且分布较为复杂。