hiPSC多能标志物的表达水平与谱系特异性分化潜能的相关性研究

目的 研究人诱导型多能干细胞(hiPSC)不同多能标志物的相对表达水平与其心肌、神经分化潜能的相关性,为hiPSC作为种子细胞在心脏、神经再生医学研究中的应用提供实验指导.方法 以人类胚胎干细胞(hESC)系h1ESC作为对照,通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测2株hiPSC细胞系多能性基因的表达水平;随后,分别利用心肌分化培养基与神经分化培养基对其进行诱导分化.在心肌分化中,通过比较搏动区域数量与面积以及心肌标志物的表达水平,鉴定不同hiPSC的心肌分化潜能;在神经分化中,通过比较早期花结样细胞团的数量与神经标志物的表达水平,鉴定不同hiPSC的神经分化潜能.最后,通过比对hiPSC多能标志物的表达水平高低与谱系分化潜能高低的对应关系,揭示两者的潜在相关性.结果 RT-qPCR结果显示,两株hiPSC相比,hiPSC-0100细胞系中SOX2表达显著较高、NANOG显著较低,hiPSC-WTB细胞系SOX2表达显著较低、NANOG显著较高(P＜0.05).在分化潜能上,形态学与RT-qPCR检测共同显示,hiPSC-0100表现相对较低的心肌分化潜能、较高的神经分化潜能,hiPSC-WTB表现较高的心肌分化潜能、较低的神经分化潜能(P＜0.05).结论 高表达SOX2、低表达NANOG的hiPSC细胞系倾向于具有较高的神经分化潜能;高表达NANOG、低表达SOX2的hiPSC细胞系倾向于具有较高的心肌分化潜能.     

造血细胞移植的进展

一般认为,骨髓移植就其本质来说与造血干细胞移植是一致的,其中主要起作用的是造血干细胞。造血细胞移植是指骨髓、胚胎肝和周围血白细胞中造血干细胞移植而言。造血干细胞可分为多向性干细胞和定向性干细胞,多向性造血干细胞(CFU-S)进一步分化为红系定向干细胞(CFU-E)和粒系定向干细胞(CFU-C)等,造血干细胞经过干细胞池、增殖池、成熟池和功能池4个阶段,发展成为各种血液有形成份。 许多因素可以影响造血干细胞的增殖和分化。各种造血器官的基质细胞所建立的特殊局部环境-造     

c-myb表达变化在造血定型、分化及造血相关基因表达中的作用

目的 通过基因打靶建立c-myb / 和c-myb /-胚胎干细胞(ES)模型,了解转录因子c-myb在造血定型和分化中的作用.方法 采用去除白血病抑制因子的甲基纤维素体外ES细胞诱导分化体系进行造血分化,收获c-myb / 和c-myb /-(表达55%的c-myb)胚胎体进行甲基纤维素克隆形成分析.运用实时定量PCR比较分析c-myb) / 和Pmyb /-造血分化过程的造血相关基因表达.结果 c-myb / 和c-myb /-ES细胞胚胎体形成相似,但c-myb /-组胚胎体体积小于c-myb / 组.两组红系克隆形成单位(CFU-E)克隆形成相似,但c-myb /-组CFU-E克隆小于c-myb / 组.两组红系爆式克隆形成单(BFU-E)均出现于第7天,高峰在第10天.两组巨噬系克隆形成单位(CFU-M)形成相似,但c-myb /-组CFU-M数目多于c-myb / 组.c-myb /-组粒-单系克隆形成单位(CFU-GM)形成数目少于c-myb / 组.PCR分析显示c-myb / 和c-myb /-组β-globin、ζ-globin、GATA 3,CD34、Lys、c-fms和c-mpl基因表达没有明显差异.结论 亚表达水平的c-myb可以满足祖细胞扩增的需要,但却影响其终末分化.亚表达水平c-myb影响前体细胞向红系和粒系的分化,但不影响巨噬细胞的分化.c-myb表达水平不影响β-globin、ζ-globin、GATA 3、CDB4、Lys、c-fms和c-mpl基因的表达.     

HDAC2介导低氧促红系分化作用

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)在低氧对人慢性髓系白血病K562细胞向红系分化中的作用.方法 K562细胞在氯化血红素诱导后分别经过低氧(1％O2,Hyp组)或常氧(20％O2,Nor组)处理后,联苯胺染色观察血红蛋白(Hb)阳性细胞率的改变,流式细胞仪检测CD235a+/CD71+细胞率的差异,Western印迹和实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测HDAC2和红系标记分子CD235a、γ-珠蛋白(γ-globin)在蛋白和mRNA水平的表达变化;最后使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)处理细胞,并用shRNA敲低HDAC2表达后评价低氧下K562细胞向红系分化的改变.结果 低氧能促进K562细胞向红系分化,并上调细胞中HDAC2的表达;抑制HDAC2活性或敲低HDAC2表达后,血红蛋白阳性细胞数减少,CD235a+/CD71+细胞的百分比降低,CD235a和γ-珠蛋白的表达也显著下降.结论 低氧能上调HDAC2表达并通过HDAC2介导K562细胞向红系分化.     

羊水来源多潜能干细胞的培养鉴定及其定向分化能力研究

目的 建立人羊水来源多潜能干细胞的体外培养体系,探讨其生物学特性和定向分化能力.方法 取人孕中期羊水标本进行原代培养,采用贴壁法分离获得干细胞.以流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,并使用特定培养基诱导羊水多潜能干细胞向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞分化.结果 体外培养的羊水干细胞呈纺锤形,增长迅速,细胞表达Oct-4、S...     

多能干细胞核心调控基因Nanog介导生殖母细胞减数分裂的作用研究

目的 探讨多能干细胞核心调控基因Nanog在原始生殖纽胞(PGCs)向生殖母细胞方向分化过程中的作用.方法 取11.0d胎鼠PGCs,按胚胎干细胞(ES)培养标准进行体外胚胎生殖细胞(EG细胞)培养.采用脂质体方法将Nanog靶向特异性小干扰RNA(siRNA)转染人EG细胞.RT-PCR、免疫荧光法检测siRNA的沉默效率;在倒置相差显微镜下进行体外克隆计数,检测EG细胞增殖未分化状态;TUNEL法和透射电镜检测EG细胞凋亡情况;半定量RT-PCR检测与生殖母细胞减数分裂相关的标志基因(Mvh、Stra8、Sycp3)的mRNA表达.结果 转染siRNA后48h EG细胞Nanog mRNA和蛋白表达明显受抑,典型未分化EG细胞克隆数量显著下降,呈现分化现象,悬浮细胞增多.TUNEL法、透射电镜检测悬浮EG细胞呈现凋亡征象.伴随Nanog表达下调,Mvh、Stra8、Sycp基因mRNA表达上调.结论 到达生殖腺后,多能性PGCs发生生殖母细胞化,开始减数分裂,该过程可能与多能干细胞核心调控基因Nanog的表达下调有关.     

高效的红细胞特异性表达系统的建立和优化

目的探讨慢病毒载体中红细胞特异性基因调控元件的优化对小鼠红白血病(murine erythroleu-kemia,MEL)细胞向红系终端分化期间组织特异性表达重组蛋白的影响。方法改变红细胞特异性β-珠蛋白启动子编码长度、改变β-珠蛋白基因位点控制区DNaseⅠ高敏位点(hypersensitive site,HS)的组合、删除β-珠蛋白3’端增强子或β-珠蛋白内含子IVS2,由此构建一系列由不同缺失组合的基因调控元件控制目的基因(如人凝血因子Ⅸ)表达的慢病毒载体,包装成重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染小鼠MEL细胞。用O6-苄基鸟嘌呤(O6-benzylguanine,BG)-卡莫司汀[1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea,BCNU]联合筛选以富集感染的阳性细胞,用酶联免疫吸附测定方法检测目的基因的表达,评估不同基因调控元件组合对重组慢病毒载体所携带的目的基因表达的影响。结果经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的慢病毒载体结构正确;三质粒系统瞬时转染人肾胚胎293T细胞包装的重组自灭活慢病毒可通过长时间高速离心有效浓缩;用50μmol/L BG-50μmol/L BCNU联合筛选可有效富集感染的阳性细胞;经环六亚甲基双乙酰胺(N,N’-hexamethyle-nebisacetamide,HMBA)诱导第8天的106个小鼠MEL细胞中表达的重组人凝血因子Ⅸ平均质量浓度达到正常水平的3.8%(191 ng/ml)。结论通过适当减少调控元件优化慢病毒载体不仅有助于提高携带的外源基因片段长度、增加载体制备的有效性、实现温和提高目的基因产物达到治疗水平需求量的目的,而且为开展以红细胞特异性表达载体介导的携带蛋白类药物的红细胞治疗以及非血液病基因治疗奠定临床前的研究基础。     

人脐带源间充质干细胞体外成脂、成骨、成软骨诱导分化

目的体外分离培养脐带来源间充质干细胞,确定其向脂肪、骨、软骨细胞的分化能力。方法取新鲜的脐带组织,剔除脐动静脉,剩余部分剪成极为细小的组织块,02%Ⅱ型胶原酶37℃静止消化17 h,用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基/Ham′s F12培养基终止消化,培养3~5 d后得到较为均一的贴壁细胞。取第3代细胞做流式检测,并定向诱导分化,14 d后成脂、成骨染色鉴定,21 d后取诱导分化的细胞团做冰冻切片,阿尔法蓝染色软骨鉴定。结果体外培养的间充质干细胞高表达CD29、CD13、CD90、CD105、CD44等间充质细胞标志物,不表达CD34、CD45、人类白细胞抗原DR等造血细胞标志物;诱导分化后油红O染色、冯库萨染色均为阳性,冰冻切片阿尔法蓝染色呈明显阳性。结论人脐带间充质干细胞在体外能够培养并定向分化为脂肪、骨、软骨细胞。     

改良胎鼠视网膜干细胞的分离培养方法

目的 对大鼠胚胎视网膜干细胞的培养方法进行改良,并观察其生长及分化特性,以期寻求有效的视网膜干细胞培养方法. 方法 取18d孕龄的SD大鼠视网膜睫状缘(CMZ)色素上皮层组织,通过剪切、吹打、胰酶消化、过滤、离心后,在DMEM/F12培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),用无血清培养技术扩增视网膜干细胞;传代后离心收集培养细胞,以5%胎牛血清诱导细胞分化;用免疫细胞化学技术对十细胞及诱导分化的细胞进行鉴定,确定所培养细胞是否为干细胞且具有分化潜能. 结果 从SD胚胎大鼠视网膜中分离的细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能够牛成新的细胞团,免疫细胞化学染色显示原代和传代细胞中Nestin和掺入BrDU均呈阳性表达.诱导分化后的细胞经鉴定证明部分表达胸腺细胞表面糖蛋白(Thy1.1). 结论 SD胎鼠视网膜内存在视网膜干细胞,通过改良方法可以进行体外培养和扩增,产生分化,部分分化细胞具有视网膜神经细胞特性,包括分化形成节细胞.     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA表达，而没有Coilagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后98.39％的细胞呈CD44^ 、HLA-DR^-。结论BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。