抗人骨髓间充质干细胞单抗(ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10)与SH2单抗的应用比较

目的 比较自制4个抗hMSCs单抗(ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10)与SH2(进口)单抗在hMSCs研究中的应用,为自制抗hMSCs单抗的应用提供依据.方法 培养能分泌抗hMSCs单抗杂交瘤细胞株(自制)及从国外购买的SH2单抗杂交瘤细胞株,将培养后的细胞腹腔注射BALB/C小鼠诱生腹水,收集腹水进行纯化,以所得纯化单抗为探针,采用流式细胞术(FACS)检测分离培养的hMSCs,并用免疫组织化学法分析了5个单抗对人来源的韧带、小肠、肺及肝等组织的特异性.结果 所制4个单抗对分离培养的hMSCs的阳性表达率分别为ZUB1:96.98％、ZUB4:98.99％、ZUC3:96.55％、ZUF10:98.91％.而SH2单抗的阳性表达率则为:86.07％;自制4个单抗对韧带、小肠、肺及肝等组织不存在交叉反应.结论 所制4个单抗在hMSCs检测等应用方面的特异性和敏感性明显优于国外购买的SH2单抗.     

一组抗人T淋巴细胞表面抗原单克隆抗体的制备及鉴定

用鼠细胞融合杂交瘤技术,获得3株分泌抗人T淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为SMU_1、SMU_2、SMU_3,为IgG_1类,不与补体结合。间接免疫荧光法表明,SMU_1、SMU_3分别与50.3±6.42%和51.5±6.37%的周血单个核细胞反应,SMU_2与68.89±9.92%的周血半个核细胞及74.68±8.08%的成熟粒细胞反应,3株单抗的分子量为54～62kD(未还原)。调变试验及竞争抑制试验表明SMU_1、SMU_3与WuT_3识别相同的抗原分子,但为不同的表位。SMU_2为一非系限性单抗。本组单抗对研究T淋巴细胞分化及临床白血病免疫分型是有意义的。     

金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备稳定分泌抗金黄色葡萄球菌肠毒素（SEI）单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的性质进行鉴定。方法：以SEI蛋白免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术,经ELISA检测筛选及3次有限稀释,获得目的杂交瘤细胞株;采用杂交瘤细胞免疫小鼠,制备并纯化了单克隆抗体,并对所获得的单克隆抗体进行性质鉴定。结果：最终获得了两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞8F7与D8,两者分别为IgG2b型与IgG1型;亲和常数分别为9.215×108L.mol^-1和1.968×1010L.mol^-1;两者均有较强的特异性,与纯化的SEG、SEE、SEC及金黄色葡萄球菌上清液均未有交叉反应;相加实验表明两个单克隆抗体识别的为相同表位。结论：单克隆抗体的成功制备,为初步建立肠毒素SEI的双抗夹心测定方法奠定了基础。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

抗人抗苗勒管激素N端439～451表位单克隆抗体的制备及其性能研究

  目的  制备抗人抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone,AMH）N端特定表位肽的特异单克隆抗体并对其特性进行鉴定。  方法  利用生物信息分析软件预测AMH特定多肽片段,合成AMH成熟N端区域的4个抗原性好的表位肽段作为筛选靶抗原。用重组AMH蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP/20细胞进行细胞融合,通过杂交瘤技术制备抗AMH单克隆抗体,用N端4个表位肽（表位1:439～451 RGRDPRGPGRAQR,表位2:273-285 PPRPSAELEESPP,表位3:42～54 DLDWPPGSPQEPL,表位4:494～506 WPQSDRNPRYGNH）分别作抗原,间接ELISA和Western blot对筛选获得的特异抗表位单抗的抗原结合特性进行鉴定。  结果  筛选到两株能够稳定分泌抗人AMH表位1（anti-AMH-1）和表位2（anti-AMH-2）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其分泌的单抗分别命名为anti-AMH-1和anti-AMH-2。该2株单抗细胞表达纯化后,检测其抗体效价分别为1∶12 000和1∶1 600。Western blot确认两种单抗除效价有差异外,识别抗原也有差异,anti-AMH-1不但能识别AMH的N端439-451表位肽,而且能识别重组AMH的氨基酸序列（rAMH）,也能识别卵巢组织。anti-AMH-2能识别rAMH和卵巢组织。  结论  成功构建了抗人AMH N端的特异表位的2种单克隆抗体。     

脂蛋白脂肪酶单克隆抗体的制备及特征分析

用牛奶纯化的脂蛋白脂肪酶(LPL),一分子量为56KD,免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术,建立了30余株分泌抗朱LPL单克隆抗体的杂交瘤细胞。对其中2E_5、2G_(10)、6D_7、8D_2、7F_4进行特征分析表明:①其抗体类别均为IgG,亚类分别为IgG_1、TgG_(2b)、IgG_(2b)、IgG_1、IgG_1;②抗体效价(细胞培养上清)5×10~(-2)——2×10~(-3);③5种单抗可认为识别三个不同的抗原表位;④Western—blot及Dot—blot结果显示各单抗均能识别纯化的LPL,与人奶均无交叉反应,与牛奶显示不同的结合特性。     

金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备稳定分泌抗金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ(SEI)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的性质进行鉴定.方法:以SEI蛋白免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术,经ELISA检测筛选及3次有限稀释,获得目的杂交瘤细胞株;采用杂交瘤细胞免疫小鼠,制备并纯化了单克隆抗体,并对所获得的单克隆抗体进行性质鉴定.结果:最终获得了两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞8F7与D8,两者分别为IgG2b型与IgG1型;亲和常数分别为9.215×108 L·mol-1和1.968×1010 L·mol-1;两者均有较强的特异性,与纯化的SEG、SEE、SEC及金黄色葡萄球菌上清液均未有交叉反应;相加实验表明两个单克隆抗体识别的为相同表位.结论:单克隆抗体的成功制备,为初步建立肠毒素SEI的双抗夹心测定方法奠定了基础.     

抗日本血吸虫童虫表膜单克隆抗体的制备

目的为制备分泌抗日本血吸虫感染保护性单克隆抗体细胞株。方法应用杂交瘤技术，将照射致弱尾蚴免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤的细胞融合。结果经两次以上有限稀释克隆化后，抗日本血吸虫童虫表膜抗原阳性率为１００％，建立了５株稳定分泌抗童虫表膜单抗的细胞株。杂交瘤细胞诱生腹水，ＥＬＩＳＡ效价达１０．６４×１０５～１１．２８×１０５。初步鉴定单克隆抗体类型分别为ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ和ＩｇＧ２ｂ。抗原抗体定位于童虫表膜。结论该单抗的制备为进一步研制抗日本血吸虫童虫表膜分子疫苗奠定基础。     

直标鼠抗人CD14单克隆抗体2F9-FITC的研制及鉴定

目的:研制异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的直标单克隆抗体2F9-FITC,用于白血病的免疫分型诊断.方法:2F9杂交瘤细胞的亚克隆,2F9腹水的制备、纯化、纯度鉴定按照常规方法进行;参考改良Marsshall氏法,制备FITC标记的2F9-FITC单抗;通过流式细胞术鉴定单抗亚型,比较2F9-FITC和标准CD14-FITC在不同类型白血病细胞上的表达情况.结果:制备了大量高纯度的IgG1κ亚型2F9单抗,成功研制了直标单抗2F9-FITC,A495/A280比值为0.44;2F9-FITC与CD14-FITC在单核细胞上反应的阳性细胞百分数分别为84.50%及90.08%,而在淋巴细胞仅为0.52%和1.01%;2F9-FITC与标准CD14-FITC在各类白血病细胞上的阳性细胞百分数的差异不显著(n=23,t=0.922,P=0.367).结论:研制的2F9-FITC能够替代进口的同类高质量单抗试剂,用于单核细胞相关性白血病的免疫诊断.     

人骨肉瘤OS-732单克隆抗体的制备及纯化

目的制备、纯化抗人骨肉瘤OS-732单克隆抗体。方法通过杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,ProteinA-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单抗,SDS-PAGE、免疫组化及ELISA检测该单抗的性质。结果SDS-PAGE鉴定单抗纯度达到93%,ELISA检测抗体免疫活性效价为1×10-7。结论制备、纯化了具有较高纯度及生物活性的的抗骨肉瘤OS-732单克隆抗体,为下一步骨肉瘤靶向治疗打下了基础。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

鼠抗早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鼠抗早孕因子（EPF）单克隆抗体,纯化并进行鉴定。方法用重组EPF免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术获得抗EPF杂交瘤细胞株,注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-G亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,用间接ELISA法测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,用Western blotting鉴定其特异性,并进行类及亚类、细胞染色体核型分析。结果筛选出2株具有较高活性和良好稳定性的分泌抗EPF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的抗体效价均高于2×10^-5,2株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,2株单抗有不同的抗原表位。SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体有较高的纯度,Western blotting表明其与EPF抗原有特异结合性。结论成功制备2株具有较高活性的鼠抗EPF单克隆抗体,为建立检测EPF方法奠定了良好的基础。     

细粒棘球绦虫囊液McAb的制备及鉴定

McAbs were prepared by fusing SP2/0 cells with spleen cells of BALB/c mice immunized with hydatid cyst fluid (HCF) antigen. Antibodies in hybrid culture supernatant were detected by ELISA, and positive hybrids were cloned by technique of limiting dilutions. Numbers of chromosomes of five hybridoma cell lines (1D1, 1D8, 2D6, 4B10, 4F4) were demonstrated in the range of 99-108. The immunoglobulin class/subclass of McAb 4F4 was IgM and the others belonged to IgG1. IHA, ELISA and I-ELISA were used for identifying titer and specificity of five McAbs. The titers of two McAbs (1D1, 1D8) reached 1:10(6)-10(7) in IHA and ELISA. Two of these McAbs (1D1, 4F4) with other parasitic antigens revealed cross-reactions. This indicated that the McAbs 1D1 and 4F4 were against common antigen determiners of different parasitic antigens and the McAbs 1D8, 2D6, 4B10 against specific antigen determiners of HCF.     

抗葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体的免疫学特性鉴定及其应用

作者以国产纯化葡萄球菌肠毒素B(SEB)免疫BALB/c小鼠制备出6株抗SEB单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系(S_1,S_2,D_1,3D_6,B_4及E_7).对其分泌的抗SEB McAb的主要免疫学特性鉴定的结果表明,6株McAb具有相同的表位特异性或构象表位相关;它们的相对亲和力由高至低依次为:S_1>D_1>3D_6>B_4>S_2>E_7;对SEB刺激外周血单个核细胞(PBMC)增殖活性的中和抑制作用不一(抑制率65.1％-22.0％).在上述鉴定的基础上,应用D_1株McAb建立的BA-ELISA及反向被动血凝试验(RPHA),检测了SEB人工污染的4种食物标本,所获敏感性分别为:0.38-0.75ng/ml及9.4-15.6ng/ml.     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp）单克隆抗体（McAb）,并对其特异性进行鉴定,用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westen blotting试验分析其特导性。结果,制备出2A5和 1H10两株能稳定分泌抗LDHp　McAb的杂交瘤细胞株,两株单抗均为IgG2b,2A5和1H10培养上清的ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水效价分别为1:25600和1:12800,两株单抗与间日疟、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应,能识别恶性疟原虫的33Kda虫源蛋白。证明制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的研制间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)单克隆抗体,并对抗体特性进行了初步鉴定。方法用纯化的重组PvLDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,测定其免疫球蛋白亚类及效价,结合ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果共获得5株稳定分泌抗PvLDH重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别为6D1、6D2、5A10、5C7、4A8。5株单抗培养上清的ELISA效价为1∶512～1∶1024,腹水效价为1∶12800～1∶25600,其中5C7、6D1经Western-blot鉴定能与天然的恶性疟原虫和间日疟原虫的LDH发生特异性反应。结论本研究方法成功制备并获得了针对PvLDH的单克隆抗体,为进一步研究疟疾诊断试剂奠定了基础。     

间日疟红内期原虫单克隆抗体Ig类别检定及种、期特异性免疫荧光分析

作者用琼脂双向免疫扩散法检定20株抗间日疟红内期原虫杂交瘤McAbs 的Ig类别及IgG亚类。结果显示:其中8株属IgG_1、9株属IgM。用IFA法对此20株杂交瘤McAbs进行种、期特异性免疫荧光的检测和分析,发现它们对间日疟原虫红内期均呈阳性反应,其中 5株与三日疟、6株与恶性疟原虫红内期有交叉反应,而对同种疟原虫子孢子期却均呈阴性反应。     

一种制备抗复合抗原单克隆抗体的方法

OBJECTIVE: To prepare monoclonal antibodies (mAbs) against multiple antigens by single cell fusion. METHODS: BALB/c mice were immunized with the multiple antigens, namely alpha fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), HBsAgiHBcAg and HBeAg, and hybridomas were employed using PEG as the fusing agent. The hybridoma cells were respectively screened with AFP, CEA, HBsAg, HBcAg and HBeAg by enzyme-linked immunosorbent assay and limited dilution. The mAbs were purified by protein G affinity chromatography, its subtype was identified, the affinity constants (K(a)) were determined and the specificity was analyzed by Western blotting. RESULTS: Twenty hybridoma cell lines were obtained by single cell fusion, including 5 cell lines against AFP, 6 against CEA, 3 against HBsAg, 4 against HBcAg, and 2 against HBeAg. The subtypes of some hybridoma cell lines positive for the mAbs were identified as the immunoglobulin G1 (IgG1), with K(a) ranging from 1x10(9) M(-1) to x10(11) M(-1). Western blot analysis showed that all the mAbs strongly and specifically bound to their respective antigens. CONCLUSION: The mAbs against multiple antigens have been obtained by single cell-fusion, which increases the production of mAbs and reduces the time of preparation.     

Production and characterization of monoclonal antibodies against fumitremorgin B

This paper reports the preparation and identification of two monoclonal antibodies against FTB, and the establishment of an indirect competitive ELISA methods for FTB determination in buckwheat, rice, and corn. Two of the hybridoma cell lines (1C9 and 2D10), which could produce specific antibodies against fumitremorgin B(FTB), were selected and developed. The affinity Kaff constants of the monoclonal antibodies with the coating antigen, FTBS-IgG, were found to be 6 x 10(8) M-1 and 9.8 x 10 M-1, respectively. The isotypes of the monoclonal antibodies are of two isotypes, IgG1 and IgM, respectively. The antibody titers were found around 1 x 10(6) and 1.5 x 10(6). The standard curves showed that as little as 5 pg of FTB in 50 mL could be detected, and the linear range of standard curve was from 10 pg to 1000 pg of standard FTB. There were no cross-reaction for McAbs in the assay system with some mycotoxins tested. The mean recovery rate from buckwheat spiked with 10-60 ng/g of FTB was 78-88.7%.     

单克隆抗体检测广州管圆线虫循环抗原的研究

目的制备抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原单克隆抗体,用于广州管圆线虫循环抗原（CAg）的检测。方法广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB／c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2／0）融合,用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹试验对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定,双抗体（单抗3F1和4H2）夹心ELISA法检测实验感染广州管圆线虫大鼠、小鼠和广州管圆线虫病人血清中的CAg。结果获得了3株稳定分泌抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原单抗的杂交瘤细胞株,经鉴定2株为IgG1（3F1、4H2）,1株为IgM（2A2）,杂交瘤细胞培养上清效价分别为1：25600、1：25600和1：12800,诱生腹水ELISA效价分别为1：80000、1：80000和1：40000。3株单抗均识别广州管圆线虫成虫相对分子量约为15000的蛋白。实验感染广州管圆线虫大鼠、小鼠血清CAg检出率分别为84．2％（48／57）和87．2％（41／47）,广州管圆线虫病人血清CAg检出率为86,4％（19／22）,与日本血吸虫、囊虫、肺吸虫、旋毛虫病人血清无交叉反应。实验感染小鼠血清CAg第2周即呈阳性反应,第4周A。。值达到高峰。结论建立了敏感性高、特异性强的3P1、4H2双抗体夹心ELISA检测广州管圆线虫循环抗原法,可用于广州管圆线虫病的临床诊断、疗效考核和流行病学调查。