含CpG基序的寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因疫苗的细胞免疫效应的影响

目的探讨人工合成的CpG ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响.方法构建编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗,人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸(CpG ODN)作为佐剂,观察其对HBV基因疫苗接种Balb/c小鼠诱导产生淋巴细胞增殖和淋巴细胞杀伤等细胞免疫应答的影响.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P＜0.05);应用CpGODN组与未应用组相比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P＜0.05).结论CpG ODN作为佐剂,对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答具有促进作用.     

CpG ODN活化外周血单个核细胞对淋巴瘤HUT-78细胞杀伤作用的研究

目的 探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)在肿瘤免疫治疗中的作用.方法 将CpG ODN刺激体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC),ELISA法检测其分泌细胞因子白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(INF-γ)的表达, MTT法检测CpG ODN作用后的PBMC对淋巴瘤细胞株HUT-78细胞杀伤活性.结果 与对照组相比,经CpG ODN作用后的PBMC对HUT-78细胞杀伤活性显著提高(P＜0.05),同时CpG ODN能明显促进PBMC分泌细胞因子IL-12、INF-γ(P＜0.05).结论 CpG ODN可增强PBMC介导的抗淋巴瘤细胞的作用,其杀伤活性与分泌细胞因子有关. Abstract： Objective To study the immunotherapy role of CpG ODN(CpGoligodeoxynucleotide) on tumor.Methods After treated with synthetic CpG ODN for 48 hours, the inhibiting effect of PBMC on HUT-78 cells were detected by MTT method.The secretions of TNF-γ and IL-12 from PBMC determined using ELISA method.Results The PBMC treated with CpG ODN enhanced their antitumor effect on HUT-78 cells and increased the secretion levels of TNF-γ and IL-12.Conclusions CpG ODN increases the cytotoxicity of PBMC on HUT-78 cells in vitro, as well as facilitates the IL-12 and TNF-γ secretion.     

微波消融联合CpG ODN治疗小鼠移植性结肠癌及对免疫状态的影响

目的 研究微波消融联合CpG ODN对小鼠移植性结肠癌的治疗作用及对免疫状态的影响.方法 Balb/c小鼠皮下接种结肠癌CT26细胞建立肿瘤模型,肿瘤分别给予瘤周注射PBS、微波消融、微波消融+瘤周注射CpG ODN和瘤周注射CpG ODN四种处理.定期测量肿瘤大小,利用流式细胞仪检测小鼠外周血中CD3+CD4T细胞、CD3℃D8+细胞的比例;采用ELISA检测小鼠外周血中IL-2、IL-12和IFN-γ含量.给予微波消融组和微波消融联合CpG ODN组治愈的小鼠再次接种CT26细胞,观察成瘤率.结果 微波消融组和微波消融联合CpG ODN组小鼠的肿瘤体积显著小于PBS组和CpG ODN组.4组小鼠外周血中的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞比例无显著性差异,微波消融联合CpG ODN组及微波消融组的CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞比值分别为1.58±0.10和1.53±0.13,与PBS组和CpG ODN组相比显著升高(P均<0.05).微波消融联合CpG ODN组小鼠外周血中IL-2浓度为(64.6±7.4)pg/ml,IL-12浓度为(314.1±26.9)pg/ml,IFN-γ浓度为(61.9±7.3)pg/ml,显著高于其他3组(P均＜0.05).肿瘤再次攻击实验中微波消融联合CpG ODN组成瘤率为25.0%,显著低于微波消融组的75.0%(P<0.05).结论 CpG ODN增强了微波消融治疗小鼠的免疫功能,减少了肿瘤再次攻击的成瘤率.     

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的ＣｐＧ ＯＤＮ作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗ＨＢｓ的影响。方法 构建编码乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原蛋白Ｓ的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,人工合成含ＣｐＧ ｍｏｔｉｆ的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作为实验动物进行免疫接种,采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠的抗ＨＢｓ应答。结果 与生理盐水作为佐剂组相比较,应用ＣｐＧ ＤＯＮ组小鼠产生更     

CpG ODN对不同来源树突状细胞活化的影响

目的比较CpG ODN-1826对BALB/C小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)和脾脏来源树突状细胞(SDC)的活化作用.方法用CpG ODN-1826体外刺激树突状细胞(DC),流式细胞术检测CD80阳性率,ELISA检测1L-12(p70)分泌水平,MTT法检测活化DC刺激T细胞增殖的能力.结果CpG ODN-1826体外可不同程度激活BMDC和SDC,诱导DC上调CD80的表达和分泌高水平IL-12,促进DC刺激T淋巴细胞增殖.CpG ODN-1826刺激的BMDC膜表面CD80表达水平明显高于SDC,其分泌IL-12的水平亦高于SDC.结论CpG ODN-1826可促进小鼠骨髓来源和脾脏来源DC的功能成熟,CpG ODN-1826刺激活化BMDC的作用明显强于刺激活化SDC.     

伤寒Ty21a-CpG佐剂减毒活疫苗诱导抗体应答的研究

目的探讨人工合成的CpG-ODN 作为佐剂对伤寒Ty21a减毒活疫苗诱导小鼠产生抗体的影响.方法将不同剂量的人工合成的含CpG ODN的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂与伤寒Ty21a减毒活疫苗混合,以小鼠作为免疫动物进行免疫接种,采用试管凝集法检测免疫小鼠的血清特异性抗体滴度.结果 CpG-ODN 30μg佐剂组与不用佐剂的Ty21a减毒活疫苗相比较,应用CpG-ODN 组小鼠产生更强的抗体应答,抗体几何均数滴度相比有明显的差异.结论 CpG-ODN作为佐剂可促进伤寒Ty21a减毒活疫苗诱导昆明小鼠产生特异性免疫应答.     

CpG ODN增强免疫力低下小鼠对乙肝疫苗的体液免疫应答

目的 探讨CpG ODN对免疫力低下小鼠的体液免疫增强作用。方法 选用老年C57BL／6小鼠和免疫抑制模型小鼠，将重组HBsAg疫苗和CpG ODN同时或单独肌注到小鼠体内，2周后以同样剂量加强免疫1次，再过3周后摘除眼球取血，用ELISA方法检测抗HBsAg IgG抗体。结果 免疫抑制模型中同时注射CpG ODN和疫苗组产生的IgG抗体绝对量是单独注射疫苗组的2倍；老年鼠组中10μg和20μg CpG ODN与疫苗同时注射组产生的IgG抗体绝对量分别是单独注射疫苗组的3倍和4倍。结论 CpG ODN能增强免疫力低下小鼠对乙肝疫苗的体液免疫应答。     

CpG ODN对非小细胞肺癌患者化疗后免疫功能的影响

 目的 测定非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者化疗前后外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）经胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（cytosine-phosphorothioate guanine oligodeoxynucleotides,CpG ODN）刺激后,CD4+CD25^high Treg细胞及IFN-γ、IL-12的变化,评价不同时间点CpG ODN的干预效果。方法 选取NSCLC患者20例,分别抽取患者化疗前（d0）、化疗后第3天（d3）及第7天（d7）外周血3 mL,分离PBMC。每份PBMC均分为实验组及对照组,实验组给予CpG ODN 2006刺激,对照组不做干预。经培养48 h后收集细胞以流式细胞仪检测CD4⁺CD25^high Treg细胞百分比,并取上清液检测INF-γ和IL-12（pg/mL）。结果 实验组CD4⁺CD25^high Treg细胞百分比在d0、d3、d7分别为（2.22±0.66）%,（2.09±0.44）%和（2.08±0.48）%,较对照组均有明显下降（P<0.05）。实验组IFN-γ在d0、d3、d7分别为（40.64±5.90）、（40.57±5.80）和（45.30±4.78）pg/mL,d0和d7时较对照组显著增加（P<0.05）,d3时变化不明显（P>0.05）。实验组IL-12在d0、d3、d7分别为（41.02±6.65）、（39.41±7.41）和（45.75±12.46）pg/mL,d0和d3时较对照组明显增加（P<0.05）,而d7时变化不明显（P>0.05）。动态观察对照组,d3时CD4⁺CD25^high Treg细胞比例下降至最低点,而后逐渐回升;实验组在d7时CD4⁺CD25^high Treg细胞比例仍持续下降;实验组的IFN-γ值呈现升高趋势,d7和d0、d3相比明显升高（P<0.05）;而实验组IL-12值在化疗前后无明显变化,即化疗前d0与化疗后d3、d7比较,以及d3与d7比较,差异均不明显（P值均>0.05）。肺癌患者化疗次数及外周血淋巴细胞的数目与CpG ODN对CD4⁺CD25^high Treg细胞比例及IFN-γ、IL-12的分泌作用无显著相关性（P>0.05）。结论 CpG ODN能有效下调CD4⁺CD25^high Treg细胞,刺激INF-γ的分泌,优化肺癌患者抗肿瘤的免疫微环境,有利于机体的抗肿瘤免疫;肺癌患者即使化疗后外周血淋巴细胞的数目明显减少,CpG ODN仍能下调CD4⁺CD25^high Treg细胞和刺激INF-γ的分泌,发挥抗肿瘤作用。     

热消融联合消融灶周边注射CpG ODN抑制小鼠肝癌生长的研究

目的 探讨热消融联合消融灶周边注射CpG ODN治疗对小鼠肝癌的影响及继发免疫效应的抗肿瘤效果.方法 建立Hepa1-6小鼠皮下肝癌动物模型32只,随机分为热消融治疗组、热消融联合CpG ODN治疗组、CpG ODN治疗组和对照组,每组8只.每组各6只接种肿瘤细胞后第7天、第14天给予治疗,测量小鼠肿瘤体积,观察荷瘤小鼠存活率及消融灶内淋巴细胞和HSP70变化,另8只第7天给予治疗,30 d后对侧接种等量肿瘤细胞,1个月后处死,观察小鼠生存状况及对侧肿瘤生长情况.结果 （1）各实验组小鼠观察期内死亡率均低于对照组（P＜0.05）,各实验组对侧均无肿瘤生长,对照组再接种肿瘤生长率为100%（3/3）,两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各实验组小鼠与对照组相比,肿瘤体积显著缩小（P＜0.05）,联合治疗组肿瘤缩小更显著;（3）各实验组较对照组有较多淋巴细胞浸润（P＜0.05）,联合治疗组数量最多;（4）各实验组与对照组相比有更多HSP70表达（P＜0.05）,联合治疗组HSP70表达最多,与其余实验组相比差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 CpG ODN对荷瘤小鼠具有明显的免疫增强作用,CpG ODN联合热消融治疗小鼠肝癌有效,且能减少复发.     

CpG ODN的体外免疫活性及其作为乙肝疫苗佐剂的研究新进展

为了增强乙肝疫苗的免疫效力,开发研制新型疫苗佐剂是当前国内外学者研究的热点之一。近年来的研究表明:含CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)在体外实验中,对人和鼠的多种免疫细胞有活化作用;在动物实验中,CpG ODN不仅可增强乙肝疫苗的体液免疫应答,还可增强其细胞免疫应答,这正是铝佐剂所达不到的,且CpG ODN与铝佐剂具有协同效应,今后可考虑双佐剂联合乙肝疫苗接种,能提高接种人群的应答率,刺激机体产生更有效的保护作用;动物实验还显示,CpG ODN能增强HBV转基因小鼠对乙肝疫苗的免疫应答和抗病毒效应,说明乙肝疫苗辅以CpG ODN可望作为临床上免疫治疗慢性HBV感染的可行性途径;Ⅰ期临床试验表明CpG ODN对人体较安全。     

CpGODN佐剂序列的筛选及其免疫刺激活性研究

目的 设计和筛选对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列,研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂。方法 根据具有免疫刺激活性的CpGODN序列结构特点,设计并合成出15条候选序列,分别合成并进行非硫代和硫代修饰。分选健康人PBMC细胞及Balb/c小鼠脾细胞,以不同CpGODN进行体外刺激,MTT法检测CpGODN诱导细胞增殖水平。随后将筛选出的有效CpGODN序列与人类基因组序列进行同源性比较,以评估其安全性。结果 在刺激人PBMC和小鼠脾细胞72h后,硫代和非硫代修饰的15条序列A值均高于阴性对照组,其中IMB-AC5序列刺激人PBMC后A值分别达到0.377和0.334,与阳性对照ISS1018序列A值(0.387和0.338)接近;刺激小鼠脾细胞72h后,A值同样高于其他序列,达到0.571和0.486,与阳性对照ISS1018序列A值(0.588和0.464)接近。综合上述结果,选择5号非硫代序列作为候选佐剂。同源性比较结果显示,该序列与人类基因组序列没有同源性,与部分蛋白编码基因的同源性只有50%~65%,此外其部分序列与人18号染色体上的一些重复序列有同源性,最高同源性达62%。证明筛选出的新型CpGODN佐剂IMB-AC5安全性较高。结论 设计筛选出对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpGODN序列IMB-AC5,与人类基因组序列具有较低同源性,为进一步研发人用疫苗佐剂奠定基础。     

CpG ODN对小鼠哮喘模型气道高反应性及炎症影响的研究

目的探讨免疫刺激序列CpG寡聚脱氧核苷酸（ODN）对小鼠哮喘模型气道高反应性（AHR）及炎症过程的影响。方法雌性C57BL／6J小鼠30只,随机分为正常对照组（A组）、模型组（B组）、CpGODN预防组（C组）、CpGODN治疗组（D组）及布地奈德治疗组（E组）,建立小鼠哮喘模型。采用有创体积描记法对小鼠进行肺功能及AHR检测;采集血、肺组织及支气管肺泡灌洗液（BALF）标本,对BALF行细胞总数计数及嗜酸粒细胞（EOS）绝对值计数,ELISA法测定血清和BALF中细胞因子IL一4、IFN—γ水平。结果B组BALF中细胞总数、EOS绝对值计数和EOS占细胞总数的百分比（EOS％）均显著高于A组（均P〈001）,C、D、E组均显著低于B组（均P〈0．01）,但仍显著高于A组（P〈0．05或0．01）。B组气道阻力增加幅度（Raw％）和肺顺应性下降幅度（Cdyn％）均显著高于A组（P〈0．01）;C、D、E组较B组显著降低（均P〈0．01）;C、D、E组肺组织炎症程度改变不一,明显比B组减轻。B组血清和BALF中IL-4的水平显著高于A组（P〈0．01）,而BALF中IFN—γ的水平显著低于A组（P〈0．01）。结论CpGODN在致敏阶段及致敏后均能明显改善哮喘肺组织炎症,降低BALF中细胞总数及EOS％;降低AHR;调节Th1/Th2细胞因子的平衡。致敏后CpGODN干预优于致敏阶段的干预。     

CD3McAb、CD28McAb、CpG ODN刺激PBMC活化的研究

目的　为肿瘤生物治疗寻找高效、安全的效应细胞。方法　采用CD3 单克隆抗体与CD2 8单克隆抗体及CpGODN共刺激外周血单核细胞活化增殖。对增殖细胞的增殖量、剂量依赖性与细胞表型进行测定。结果　单用CD3 单克隆抗体和小剂量的IL - 2就可以引起PBMC有效扩增 ,CD2 8单抗可提供协同刺激信号 ,使PBMC扩增达到最高。而CpGODN亦可提供第二信号 ,但较CD2 8单抗为弱。CD2 8协同扩增呈剂量非线性相关型 ,而CpGODN则为剂量正相关。表型测定表明共刺激细胞中NK细胞比率明显增高 ,分别达到 33.1 0 %± 1 3.82 % (CD3 CD2 8) ,2 9.5 0 %± 1 3.2 0 % (CD3 CPGODN) ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。同时 ,CD4 CD8 T细胞比值发生倒置。结论　CD2 8、CpGODN均能协同CD3 单抗诱导PBMC活化增殖 ,CD2 8单抗激活无剂量线性相关 ,而CpGODN激活有剂量正相关。激活的细胞是以NK细胞、CD4 CD8-、CD4- CD8 T细胞为主体的异质细胞群。     

CpG ODN通过活化p38 MAPK上调A549细胞β防御素-2的表达

目的研究含CpG基序的寡核苷酸（unmethylated CpG motif containing oligodeoxynucleotide,CpG ODN）对人肺腺上皮细胞A549β防御素-2（humanβ-defensin 2,hBD-2）的表达及p38 MAPK磷酸化水平的影响。方法培养A549细胞,加或不加p38特异性抑制剂SB203580情况下用不同浓度CpG ODN进行干预。用RT-PCR法检测刺激后A549细胞hBD-2 mRNA表达变化,用Western Blot法检测细胞内p38MAPK蛋白磷酸化水平的变化。结果 CpG ODN刺激可以促进A549细胞内磷酸化p38 MAPK含量的增加,活化p38 MAPK途径,从而诱导hBD-2的表达,与对照组比较,P〈0.05;用特异性阻断剂SB203580阻断p38 MAPK磷酸化可抑制CpG ODN的诱导作用。结论 CpG ODN通过p38 MAPK途径诱导hBD-2在呼吸道上皮细胞的表达,增强呼吸道对外界微生物的抵抗作用。     

未甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸对小鼠脾细胞产生免疫球蛋白E的抑制作用

 【目的】探讨未甲基化CpG的寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）在体外对小鼠脾细胞和纯化B细胞产生免疫球蛋白E（IgE）的作用及其机制。【方法】在体外，小鼠脾淋巴细胞和纯化B细胞与白细胞介素4（IL-4）＋抗CD40单克隆抗体（anti-CD40）在CpG ODN存在或不存在的条件下刺激3d或7d后，用酶联免疫吸附试验法检测IgE的水平，用流式细胞仪检测CD19阳性B细胞的分裂及活化情况。【结果】CpG ODN呈剂量及时间依赖性地抑制由IL-4＋anti-CD40诱导的小鼠脾细胞IgE的产生，anti-IFN-1mAb及anti-IL-12mAb不能完全拮抗CpG ODN对kE产生的抑制作用。同样地，CpG ODN抑制小鼠纯化B细胞IgE的产生。进一步分析结果表明，CpG ODN促进B细胞活化及共刺激分子CD80的表达，但抑制B细胞分裂。【结论】CpG ODN直接作用于B细胞而发挥对IgE的抑制作用，该研究为基础和临床研究提供科学理论依据。     

不同剂量CpG ODN联合STAg鼻内免疫BALB／c小鼠诱导的免疫应答

目的 观察弓形虫可溶性速殖子抗原（STAg）与不同剂量的CpG ODN联合滴鼻免疫小鼠的免疫效果，探索CpG ODN佐剂最佳剂量。方法 5-6周龄BALB／c小鼠50只随机分为5组，每组10只，实验组以20μg STAg联合不同剂量CpG ODN佐剂滴鼻免疫小鼠，佐剂剂量分别为0、1、5、10μg，对照组以PBS滴鼻，间隔2wk免疫2次。末次免疫后30d断颈处死全部小鼠，分离脾、Peyer＇s patch（PP结）、肠系膜淋巴结（MLN）和IEL淋巴细胞，观察淋巴细胞增殖情况。用ELISA的方法检测血清IgG和粪便IgA含量。结果 与PBS组和0剂量佐剂组相比，10μg CpG ODN联合STAg免疫后，小鼠肠粘膜淋巴组织和脾淋巴细胞增殖明显（P〈0．05）。10μg组血清IgG远高于对照组（P〈0．05），粪便IgA高于对照组（P〉0．05）。结论 CpG ODN可作为STAg的粘膜佐剂，10μg CpG ODN与STAg联合具有最佳的免疫效果。     

多种属CpG ODN诱导特异性抗体反应的研究

目的 探讨人工合成的CpG ODN对不同物种的免疫刺激活性,开发具有广谱免疫刺激活性的CpG ODN.方法 将特定的CpG ODN单独或与不同的抗原联合分别免疫鸡和小鼠,用ELISA检测不同时间鸡和小鼠特异性抗体的滴度.结果 CpG ODN均能诱导鸡和小鼠产生抗原特异性抗体,且抗体水平明显高于对照组(P＜0.05).结论 这种CpG ODN在一定程度上具有广谱免疫刺激特性.     

CpG ODN与聚肌胞在肿瘤免疫中联合应用的研究

目的选择两种新型的生物型免疫刺激剂CpGODN和poly(I:C)联合作为多肽抗原佐剂,通过体外及体内多种免疫功能指标检测,探讨二者联合应用的免疫增效作用。方法体外实验中用CpGODN和poly(I:C)单独或联合与正常小鼠脾细胞混合培养,24h后检测细胞培养上清中细胞因子分泌情况;体内实验中用CpGODN和poly(I:C)单独或者联合作为MUC1多肽抗原的佐剂免疫小鼠,通过ELISA方法检测免疫血清中抗体效价及应用细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验对各组间免疫水平的差别进行评价。结果CpGODN与poly(I:C)联合应用体外能有效诱导脾细胞分泌IL-12p40和TNF-α。体内实验联合组小鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平升高,IL-4水平降低。小鼠血清中抗MUC1多肽抗体效价各组间差别无统计学意义(P>0·05),但细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicityTlympho-cyte,CTL)杀伤实验显示联合组能有效杀伤靶细胞。结论CpGODN和poly(I:C)联合作为可溶性多肽MUC1的免疫佐剂,与单用相比能有效地增强机体的抗肿瘤免疫应答反应。     

肿瘤靶向载体N-正辛基-N′-琥珀酰基壳聚糖的制备和结构表征

目的:对壳聚糖的结构进行修饰,制备N-正辛基-N′-琥珀酰基壳聚糖。方法:以壳聚糖为原料,通过与正辛醛、丁二酸酐反应,在其2位氨基引入琥珀酰基和正辛基。产物用FTIR、1HNMR、元素分析对其进行表征。用粉末X-衍射、DSC、TG对其物理性质进行分析,并初步考察了其对K562肿瘤细胞的亲和性。结果:合成了N-正辛基-N′-琥珀酰基壳聚糖,其结晶程度下降,水溶性增加,与K562肿瘤细胞亲和性较好。结论:N-正辛基-N′-琥珀酰基壳聚糖可作为新型肿瘤靶向载体。     

CpG寡核苷酸对人外周血淋巴样树突状细胞的增殖作用

目的　观察不同剂量的鸟嘌呤寡核苷酸 (CpGODN)对健康人外周血淋巴样树突状细胞 (DC2 )的增殖作用。 方法　用浓度为 4μm、1μm及 0 .1μm的CpGODN2 2 16单独或联合肿瘤抗原刺激健康人外周血新鲜分离的单个核细胞。培养 48h后用流式细胞术检测单个核细胞中DC2含量。结果　CpGODN2 2 16能显著刺激DC2增殖 ,使其数量增加。结论　CpGODN 2 2 16能有效促进淋巴样树突状细胞的增殖。