线粒体钙超载激活线粒体凋亡途径在甲基汞致神经元凋亡中的作用

目的 探讨线粒体钙超载并诱导线粒体凋亡途径活化在甲基汞致神经元凋亡过程中的作用及其机制。 方法 取出生24 h内的新生昆明小鼠,解剖取脑皮质,进行原代神经元培养。细胞发育成熟后,应用含不同浓度甲基汞(methyl-mercury,MeHg,0、0.25、0.5、1 μmol/L)的培养液分别处理神经元1、3、6 h,测定神经元细胞活力,确定适宜暴露时间后,测定神经元线粒体内钙离子水平,线粒体膜电位,细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)、凋亡诱导因子(apoptosis induce factor,AIF)、天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3, caspase 3)蛋白表达水平及细胞凋亡率。 结果 神经元经不同浓度MeHg处理后,细胞活力降低。在0.25、0.5、1 μmol/L MeHg处理组,神经元线粒体内钙离子水平升高,线粒体膜电位下降,Cyt c、AIF、caspase3蛋白表达水平升高,细胞早期凋亡率升高,且都呈现剂量效应关系。在1 μmol/L MeHg处理组,上述指标与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。 结论 甲基汞暴露会诱发神经元线粒体钙超载并激活线粒体凋亡途径进而导致细胞凋亡。     

甲基汞致小鼠肝细胞DNA的损伤

目的：研究甲基汞对小鼠肝细胞DNA损伤。方法：利用单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE)技术检测1／200 LD50,1／20 LD50,1／2 LD50的甲基汞对肝细胞DNA损伤的情况。结果：体内给予小鼠1／200 LD50,1／20LD50,1／2 LD50的甲基汞,作用12h,其肝细胞的存活率降低,DNA损伤率均增高,且存在明显的剂量－效应关系;体外给予不同剂量的甲基汞作用1h即可使肝细胞DNA损伤率明显增高,结论：甲基汞可以引起小鼠肝细胞DNA损伤。     

甲基汞诱导海马神经细胞凋亡及其机制研究

目的 研究甲基汞对海马神经元的损伤及致凋亡作用,并初步探讨甲基汞神经毒性的机制.方法 以5 d内新生SD大鼠海马神经元为实验对象,用四甲基偶氮唑盐(MMT)法检测甲基汞对培养的海马神经细胞活性的影响,原位末端标记(TUNEL)法和流式Annexin V-FITC-PI法检测甲基汞诱导海马细胞凋亡细胞数和凋亡百分率,并用激光共聚焦技术,从单个细胞水平检测甲基汞对胞内游离Ca2 瞬间动态变化的影响.结果 MMT法显示,0.1 μmol/L甲基汞作用24 h对培养的海马神经细胞杀伤率为(22.90±2.77)%(n=7).TUNEL法显示,0.1 μmol/L甲基汞作用24 h组海马神经元凋亡指数[(34.45±1.30)%,n=10]高于溶剂对照组[(6.01±0.64)%,n=10],差异有统计学意义(P＜0.01).流式Annexin V-FITC-PI法显示,0.1 μmol/L甲基汞作用24 h诱导海马神经细胞凋亡率为(51.20±4.98)%(n=5).即时染毒0.01、0.1、1 μmol/L甲基汞,使海马神经元细胞内游离钙离子浓度分别增加(5.58±2.37)%(n=5),(82.71±20.42)%(n=4)和(246.38±64.77)%(n=4).预孵育硝苯的平可延缓甲基汞升钙作用的起效时间并降低胞内钙离子浓度增加的幅值.结论 甲基汞对培养的海马神经细胞的急剧升钙作用可能参与了甲基汞的致细胞损伤和诱导凋亡作用,并且可能与细胞膜上的电压门控钙通道有关.     

氯化甲基汞致脑发育损伤形态学研究

目的:探讨氯化甲基汞(MMC)致大鼠不同发育阶段脑组织形态结构改变。方法:雌性Wistar大鼠体重(120±20)g,随机分为3个实验组和对照组各30只。3个实验组母鼠从妊娠前90天至仔鼠出生后30天连续喂饲含有不同剂量(0.75、1.50和3.00 mg/kg)MMC的普通饲料,对照组给予普通饲料。脑切片经苏木精-伊红染色,在光镜下观察长期接触低剂量MMC仔鼠脑组织形态结构。采用荧光原位末端标记法,在激光共聚焦显微镜下计数两组生后不同时间点仔鼠大脑、小脑和海马发生凋亡的神经元,以PCD阳性率表示凋亡的多少。结果:在实验设计的接触剂量下,仔鼠大脑、小脑和海马神经元体积缩小、固缩,核染色质致密等凋亡形态特征。实验组和对照组生后不同时间点仔鼠脑神经元都存在凋亡。结论:大鼠长期低剂量接触不同浓度MMC可使其生后仔鼠大脑、小脑和海马部分神经元出现凋亡形态学改变,随仔鼠脑汞含量升高神经元凋亡率明显增加。     

甲基汞对脑神经胶质细胞凋亡及c-fos表达的影响

为探讨氯化甲基汞 (MMC)所致脑发育损伤及其与c fos表达的关系 ,采用光镜、电镜等形态学方法 ,观察了MMC对体外培养的大鼠脑神经胶质细胞的损害作用 ,并应用免疫细胞化学方法 (SP法 )观察MMC对培养神经胶质细胞c fos表达的影响。结果表明 ,体外培养的胶质细胞接触MMC后 ,出现胞浆浓缩、轴突回缩、染色质边聚、固缩等现象 ,呈凋亡的典型形态。MMC 0 0 2mmol L作用于神经胶质细胞 10min后 ,c Fos蛋白阳性细胞百分率随其后的培养时间而变化 :c Fos蛋白阳性细胞率 0 5h开始增高 ,2h达高峰 ,4～ 6h又逐渐减少。MMC 0 0 0 12 5、0 0 0 5、0 0 2、0 0 8和 0 32mmol L作用 10min后 ,0 32mmol L组的阳性率显著高于除0 0 8mmol L组外的其他各组 (P <0 0 1)。提示MMC可诱导体外培养大鼠脑神经胶质细胞c fos表达 ,并诱发其凋亡。MMC诱发神经细胞凋亡可能与c fos介导有关。     

甲基汞对小鼠睾丸生殖细胞凋亡作用

目的研究甲基汞对小鼠睾丸生殖细胞凋亡及其作用机制。方法采用原位末端标记（TUNEL）和免疫组织化学方法研究甲基汞对小鼠睾丸生殖凋亡及其凋亡基因的表达。结果甲基汞可使雄性小鼠睾丸生殖细胞的凋亡率增加，随着甲基汞染毒剂量的增加，1150LD50、1／10LD50组凋亡率与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．0S）。1／10LD50剂量染毒组低于1150LD50组，差异无统计学意义（P〉0．05）。Fas、Fas—L、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（caspase-3）表达增强，11100LD50组阳性表达率最高，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），随着染毒剂量的增加。各染毒组的阳性表达率有所下降。结论甲基汞可以诱导雄性小鼠生殖细胞的凋亡。     

铀矿尘对人正常支气管上皮细胞株细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的探讨铀矿尘对人正常支气管上皮细胞株HBE细胞凋亡相关蛋白表达的影响及凋亡的可能机制。方法体外培养HBE细胞,分为对照组、铀矿尘组(12.5、25、50、100、200μg/ml)。细胞染毒12 h后,用MTT法检测HBE细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化法检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及细胞色素C(CytC)、半胱天冬酶-3(caspase-3)和半胱天冬酶-9(caspase-9)的蛋白表达。结果当铀矿尘浓度为25~200μg/ml时,HBE细胞存活率均低于对照组,细胞凋亡率和坏死率均高于对照组,差异均有统计学意义(P0.01)。随着铀矿尘浓度的升高,HBE细胞Bax、Bcl-2、CytC、caspase-3、caspase-9蛋白表达量逐渐增加,均高于对照组,差异均有统计学意义(P0.05或P0.01)。结论铀矿尘对HBE细胞的凋亡作用可能是通过线粒体途径实现的。     

氯化甲基汞及三氧化二砷对K562细胞凋亡的影响

目的研究氯化甲基汞（MMC）及三氧化二砷（ATO）对K562细胞凋亡的影响。方法K562细胞经1．25、2．5、5、10和20μmol／LMMC或ATO作用24h，采用FITC-“Annexin”V／PI双染法进行细胞凋亡率的检测。结果K562细胞接触不同剂量MMC或ATO 24h，随着剂量增加凋亡率不断增加，5．0μmol／L的细胞凋亡率分别为（31．54±6．35）％和（25．37±7．68）％，与空白对照组（10．36±3．23）％比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论MMC及ATO均能促进K562细胞凋亡，且呈剂量依赖性。     

线粒体介导细胞凋亡的研究进展

线粒体在调节细胞凋亡过程中发挥关键性的作用.在细胞凋亡过程中,线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)过度开放,线粒体跨膜电位降低,还会导致一些相关的促凋亡因子,如细胞色素C(cytochrome c)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族以及膜间隙中的caspase前体蛋白(pro-caspase)等从线粒体释放到胞质中,同时线粒体内的Bcl-2家族对细胞凋亡具有双向调节作用.研究线粒体在细胞凋亡中的作用机制,对于研究细胞凋亡的调控机制具有非常重要的理论意义.笔者以线粒体及细胞凋亡的最新研究进展为基础,对线粒体在介导细胞凋亡中的关键性作用进行综述.     

金雀异黄素诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡及其机制研究

目的探讨金雀异黄素对结肠癌细胞HCT-116的细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。方法不同浓度金雀异黄素处理HCT-116细胞,MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡、细胞内活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位的变化,并用透射电镜观察细胞的超微结构。结果金雀异黄素呈剂量和时间依赖性地抑制细胞增殖。0~100μmol/L的金雀异黄素处理细胞24 h后引起G2/M期阻滞,凋亡峰Sub-G1所占细胞比例从(1.63±0.44)%增至(8.33±1.51)%(P0.01),早期凋亡细胞从(1.93±0.32)%增至(7.25±0.86)%(P0.01)。透射电镜下细胞出现凋亡特征性改变。100μmol/L金雀异黄素处理后细胞内ROS水平在2 h时增至处理前的1.81倍,(15.53±1.55)%vs(8.57±0.35)%,P0.01,细胞线粒体膜电位在1 h时迅速下降了87.8%,(0.82±0.02)%vs(6.70±0.21)%,P0.01。结论金雀异黄素抑制结肠癌细胞株HCT-116的细胞增殖,引起G2/M期细胞阻滞并促进细胞凋亡,可能与升高细胞内ROS水平,降低线粒体膜电位有关。     

甲基汞对大鼠胚胎细胞毒性和相关基因表达的影响

目的从细胞和基因水平揭示甲基汞的发育毒性作用机理。方法应用体外／体内大鼠模型、原位杂交等方法观察甲基汞（体外染毒剂量依次为０、０．０５、０．１０、０．２０、０．４０、０．８０和１．６０ｍｇ／Ｌ;体内染毒剂量依次为０、０．２、０．４、０．８、１．６和３．２ｍｇ／ｋｇ）对９．５天龄大鼠胚胎细胞行为和基因表达的影响。结果甲基汞能通过卵黄囊胎盘,但高浓度可抑制胎盘发育和血管分化;甲基汞对胚胎的发育毒性与其浓度间存在剂量反应关系,胚胎畸形的主要表现是神经管未闭和体位异常。甲基汞能激发胚胎细胞过度凋亡,明显抑制细胞ＤＮＡ和ＲＮＡ的合成,损害胚胎细胞超微结构。甲基汞能诱发热休克蛋白７０基因大量表达,抑制纤维连接蛋白基因和ｐ１６基因的表达;热休克蛋白７０基因、Ｃａ２＋、细胞凋亡与畸形的发生之间具有相关性。结论胚胎细胞行为和相关基因表达异常在甲基汞的发育毒性作用机理中起重要作用。     

青蒿琥酯联合热疗诱导肺腺癌A549细胞凋亡作用

目的 探讨青蒿琥酯联合热疗诱导肺腺癌A549细胞凋亡的线粒体途径作用机制。方法 150μmol/L青蒿琥酯、青蒿琥酯联合热疗(43℃,1h)作用A549细胞24h,流式细胞技术检测细胞周期和凋亡率情况。荧光显微镜观察线粒体膜电位变化。免疫组化、western blot检测细胞色素c、Bcl-2和caspase-3表达,CaspACETM检测试剂盒检测活性caspase-3表达。结果 青蒿琥酯、青蒿琥酯联合热疗作用A549细胞24h后,G0/G1期细胞数增多,S期和G2/M期细胞数减少(P<0.01);凋亡率分别是16.77%和28.90%(P<0.01)。线粒体膜电位下降率分别为18.05%,50.98%(P<0.01)。细胞色素c蛋白、caspase-3表达增加而Bcl-2蛋白表达减少(P<0.01)。活性caspase-3蛋白水平增加A值分别为0.2641±0.0027,0.3613±0.0019,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 青蒿琥酯、青蒿琥酯联合热疗可诱导肺腺癌A549细胞凋亡,激活线粒体途径可能是诱导凋亡重要作用机制。     

小蘗碱诱导人宫颈癌Hela细胞株凋亡的作用

目的:探讨中药黄连素对子宫颈癌Hela细胞株的增殖抑制和诱导凋亡的作用。方法:以不同浓度的黄连素(10、20、40、80μmol/L),分12、24、48、72h四个时间点处理Hela细胞,光镜观察细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率;用透射电子显微镜及琼脂糖凝胶电泳检测凋亡发生情况。结果:黄连素可抑制Hela细胞增殖,作用呈明显的时效和量效关系,差异有统计学意义(P<0.01);黄连素可诱导Hela细胞凋亡,透射电子显微镜下可见凋亡细胞;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA"梯状"条带。结论:黄连素体外对Hela细胞具有增殖抑制作用和促进凋亡作用。     

肿瘤坏死因子受体相关因子及蛋白表达对氢醌诱导HL-60细胞凋亡的影响

目的研究体外培养条件下肿瘤坏死因子受体相关因子及蛋白（TYRAP）表达对氢醌诱导人HL．60细胞凋亡的影响，以探讨TYRAP表达与氢醌诱导HL-60细胞凋亡的关系。方法流式细胞术ANNEXINV-FITC加碘化丙啶（PI）双染定量检测细胞凋亡率和坏死率的变化；反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测TYRAP在mRNA水平的表达量，比较不同处理组之间的差异。结果加入不同浓度氢醌培养0、4、8、12h后，流式细胞术检测结果发现，不同浓度氢醌作用后，细胞凋亡率明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P〈0．01），氢醌诱导细胞凋亡的最佳浓度为200μmol／L，而当氢醌浓度为250μmol／L时，细胞坏死率明显增高，浓度为20μmol／L氢醌诱导的细胞凋亡，随着作用时间的延长，凋亡率明显增高，作用8h达高峰，而后细胞凋亡率下降，坏死率增加。作用8h时，随着氢醌浓度的增加，细胞凋亡率明显增加，TTRAP基因在mRNA表达水平也相应明显增加；当浓度增加到250μmol／L时，细胞坏死率增加，TYRAP基因表达量下降。结论体外培养条件下，TYRAP的表达上调可能对氢醌诱导HL-60细胞凋亡起促进作用，并存在剂量-效应与时间-效应关系。     

甲基汞对大脑皮层神经细胞内游离钙的影响

目的　研究甲基汞对急性分离的大脑皮层神经细胞内游离Ca2 水平的影响。方法　采用钙离子指示剂Fura 2双波长荧光检测技术。结果　 (0 10～ 5 0 0 )× 10 -6mol/L甲基汞可使大脑皮层神经细胞内游离Ca2 水平显著升高 ,且有剂量 效应关系。甲基汞升高神经细胞内游离Ca2 的作用与胞外Ca2 大量内流和胞内储Ca2 释放有关 ,且以胞外Ca2 内流为主。胞外Ca2 内流与N 甲基 D 天冬氨酸受体门控Ca2 通道以及电压门控Ca2 通道有关 ,而与电压依赖性Na 通道无关。结论　甲基汞可使神经细胞内游离Ca2 浓度异常升高 ,且与Ca2 通道有密切关系。     

急性氯化甲基汞染毒大鼠脑某些抗氧化指标的变化

目的 对SD大鼠经腹腔注射氯化甲基汞(MeH必)的急性染毒方式，观察其对大鼠脑组织和血清某些抗氧化指标的变化。方法 用甲基汞对大鼠染毒24h后，断头处死，取血清和脑组织检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。结果 染毒24h后，5．00mg／kg和10．00mg／kg剂量的大鼠脑组织匀浆和血清中的GSH—Px活性和S0D活性下降，MDA含量上升。结论 甲基汞染毒24h后，GSH—Px和SOD活性下降，MDA含量上升，表明这种作用对MeHgCl引起的神经毒性有一定的敏感性。MeHgCl可使脑组织和血清中某些抗氧化指标发生变化。     

丁酸对结肠癌细胞株凋亡的影响

目的:观察膳食纤维在结肠中的酵解产物丁酸对人结肠癌细胞株细胞凋亡的影响,探讨其预防结肠癌的作用机制.方法:人传代结肠癌细胞株SW1116经不同浓度(2、3、4、7和10 mmol/L)丁酸处理后,在不同时段(6、24、48和72 h)收集细胞,分别用四唑蓝法检测肿瘤细胞生长的增殖率,用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化,以及用电镜观察其形态学改变.结果:随着培养液中丁酸浓度的不断升高和培养时间的延长,SW1116细胞的生长逐渐受到抑制,最高抑制率达59.19%.同时G1期细胞明显增多,而S期细胞明显减少,而细胞凋亡率逐渐增高,最高达30.62%,电镜观察出现细胞凋亡的特征性改变.结论:丁酸既能抑制结肠癌细胞的生长增殖,又能诱导其细胞凋亡.     

三磷酸甲酯中毒致母鸡脊髓神经元凋亡的研究

目的　研究细胞凋亡机制在有机磷中毒后的动物迟发性神经病 (OPIDN)中所起的作用及其动态病理改变。方法　采用给母鸡一次性肌内注射三磷酸甲酯染毒的方法建立OPIDN动物模型 ,以染毒后 3、5、7、10、14、18d为时间点分别取材 ,以HE染色、尼氏法和原位末端标记法 (TUNEL)观察其第三腰髓 (L3 )的病理改变、神经元数量及细胞凋亡的变化。结果　母鸡于肌内注射三磷酸甲酯后第 9天前后出现进行性共济失调和肌无力等OPIDN的典型症状。HE染色示染毒后 5d后母鸡脊髓前角大神经元出现细胞核红色深染 ,至 18d消失 ;尼氏法染色示母鸡脊髓前角神经元数量呈进行性减少 [从 (82±4)个 /mm2 到 (66± 6)个 /mm2 ] ;TUNEL法示母鸡腰段脊髓TUNEL阳性细胞于染毒后 5d左右开始出现[(2 2± 2 )个 /mm2 ] ,以 7d[(2 7± 3 )个 /mm2 ]数量最多 ,18d消失。结论　在母鸡OPIDN发病过程中出现腰髓前角神经元细胞凋亡现象。提示细胞凋亡可能在OPIDN发病机制中起重要作用     

自噬基因Beclin1过表达诱导人卵巢癌细胞SKOV3自噬和凋亡的研究

目的:探讨自噬基因Beclin 1在人卵巢癌SKOV3细胞中过表达对其体外生长活性的影响。方法:构建自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,将其稳定转染SKOV3细胞,实现Beclin 1在SKOV3中的过表达;用MTT法分析Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,用流式细胞仪检测凋亡和自噬情况,电镜和荧光显微镜下观察自噬现象。结果:pcD-NA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后Beclin 1在mRNA和蛋白水平均高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组。Beclin 1在SKOV3中的稳定过表达后G1期细胞明显增多,S期细胞比例明显减少,细胞增殖受到抑制,凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后MDC标记的自噬囊泡平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组。pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后在电镜下可见大量自噬囊泡形成。在荧光显微镜下见pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞中MDC标记的自噬囊泡明显增加。结论:自噬基因Beclin1过表达可诱导人卵巢癌细胞SKOV3自噬和凋亡,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性。