基于简化基因组测序技术的甘薯HRM分子标记开发及其应用

目前甘薯中针对SNP位点的分子标记开发及应用的报道较少。为开发甘薯特异SNP分子标记,本研究利用简化基因组测序技术对甘薯种质材料进行测序,筛选稳定的SNP位点,将其开发为基于HRM技术的分子标记,并在甘薯种质材料中进行验证。通过对23个甘薯种质材料简化基因组测序数据的分析,共发现835 756个SNP多态性位点,筛选其中的3 650个含有SNP多态性位点的高质量测序片段,成功设计了134对引物;初步验证发现,22对(16.42%)引物没有扩增产物,15对(11.19%)引物扩增产物2个以上,36对(26.87%)引物的扩增产物没有差异。61对(45.52%)引物在8个样本中的扩增特异性好,而且样本之间有差异。最后筛选34对扩增多态性丰富的引物对52份甘薯种质材料进行扫描,发现材料间多态性介于27.27%~90.91%之间,平均多态性达到59.35%。聚类分析表明,参试52份甘薯种质材料之间的差异较小,多数材料与骨干亲本南瑞苕、徐薯18之间关系较近,国外引进甘薯材料和地方品种差异较大。建议在今后甘薯育种中尽量选用地方品种和国外甘薯品种,从而更好地拓宽甘薯遗传背景。本研究初步建立了基于简化基因组技术和HRM技术开发甘薯SNP分子标记的新思路,为今后甘薯SNP分子标记开发提供了参考。同时本研究开发的甘薯分子标记,丰富了甘薯分子标记类型,为甘薯研究者开展快速的分子标记研究提供了支持。     

分子标记转育3个基因改良空育131稻瘟病抗性

为改良空育131的稻瘟病抗性,通过杂交和分子标记辅助选择技术将中金23的Pi-1、Pi-2和Pi-33稻瘟病抗性基因导入到受体亲本空育131中,并通过连续回交结合农艺性状筛选,获得了28个含有不同抗稻瘟病基因的空育131导入系,其中同时含有Pi-1、Pi-2和Pi-33这3个抗性基因的株系k165、k166和k191对稻瘟病的抗病频率均达到了98.4%,明显高于携带1个和2个抗性基因的株系,且k165的综合农艺性状已接近空育131,表明通过分子标记辅助选择聚合稻瘟病抗性基因是开展品种抗性定向改良的有效方法之一。     

利用分子标记辅助选择Pigm-1基因改良恢复系R20的稻瘟病抗性

水稻稻瘟病是水稻的重要病害之一,给我国甚至全世界的水稻安全生产带来了巨大隐患.选育优质抗稻瘟病恢复系,进而培育稻瘟病水稻杂交组合,是选育抗稻温病品种的有效途径之一.本研究以双抗77009为抗性基因Pigm-1的供体亲本,以感病恢复系R20为受体亲本,通过杂交和连续回交方法,并利用分子标记辅助选择技术,定向改良优质水稻恢...     

分子标记在稻瘟病研究中的应用

稻瘟病属于水稻种植中一种常见的病害,给水稻产量和质量造成了较多的不利影响,因此,需要科研人员从分析生物学角度出发,应用分子标记技术对发生稻瘟病水稻的抗瘟基因进行研究,借助于该种基因研制可以有效抵御稻瘟病的水稻品种,以此控制稻瘟病的发病率,实现水稻生产数量和品质的提高。基于此,对当前稻瘟病的发病原因、抗病基因的研究情况进行了概述,结合研究成果分析了分子标记的定义,种类,重点介绍了分子标记在稻瘟病研究中的应用。     

RAPD校正及玉米肿囊腐霉抗性基因的分子标记

RAPD校正是指以RAPD的扩增能力为尺度对DNA模板进行调速以使RAPD具有最合适的扩增能力。RAPD校正的理论 可重复的碱基误配率的存在以及RAPD片段间的扩增竞争，误配率的大小决定了RAPD竞争性条带的有无和强弱，本研究应用RAPD校正的DNA对玉米肿囊腐霉抗性基因的分子标记进行了筛选，找到一个呈反向连锁的分子标记DPB17800，其遗传距离为8.1cM。结果一,RAPD有显著地提高RAPD扩增的重复性。     

一个与水稻条纹叶枯病抗性基因紧密连锁的分子标记的鉴定

针对水稻条纹叶枯病粳型(Oryza sativa ssp. japonica)抗源镇稻88尚无可供育种利用的分子标记的现状,以镇稻88和感病品种武育粳3号配组构建F2作图群体。在采用单分蘖鉴定和苗期接种鉴定方法对F2群体和F2:3家系分别进行抗性遗传分析的基础上,通过标记分析表明,RAPD标记OPO11与镇稻88中抗性基因紧密连锁,表现为共分离。使用该标记对徐稻3号等3个镇稻88衍生抗性品种进行分析,结果表明,RAPD标记OPO11可应用于镇稻88与武育粳3号组合及其衍生组合的分子标记辅助选择。     

基于PSY2基因单碱基突变的木薯薯肉颜色分子标记开发与利用

木薯块根颜色是消费者关注的重要性状之一,薯肉颜色主要受八氢番茄红素酶PSY2基因控制.为了快速判断木薯块根肉质颜色,本研究基于编码八氢番茄红素合成酶基因的突变位点PSY2-572,开发出1个单核苷酸扩增多态性(SNAP)标记,可快速检测木薯块根肉质颜色.利用该PSY2-SNAP标记鉴定出的新选048自交群体和62个育种...     

长三角地区粳稻种质的稻瘟病抗性基因鉴定及其抗性评价

已克隆的抗稻瘟病基因Pi9、Pib、Pi5、Pita、Pi2、Pikh、Pikm和Pigm对稻瘟病菌表现广谱抗性,这些基因已广泛应用于水稻抗稻瘟病育种.为了明确长三角地区粳稻的抗稻瘟病基因分布及其抗性表现,利用上述8个抗病基因的功能标记对52份粳稻种质进行抗病基因检测.同时,利用江苏省2019年稻瘟病菌代表菌株2019...     

基于石蒜属转录组序列的SSR分子标记开发应用

为开发石蒜属简单重复序列(SSR)分子标记,并研究SSR引物在石蒜属内的通用性,本研究对石蒜属石蒜、忽地笑、中国石蒜、长筒石蒜、换锦花、香石蒜6个种质转录组测序,检测SSR位点并设计引物,通过PCR扩增和毛细管电泳判断引物的有效性和多态性,绘制石蒜属17个种质资源的指纹图谱并对杂交后代的真实性进行早期检测。结果表明,共获得404 481条Unigenes,利用数据库进行同源比对和功能注释,并对Unigene进行SSR位点挖掘和分析,共检测到59 612个SSR位点。其中,单核苷酸重复>二核苷酸重复>三核苷酸重复,分别占SSR总数的62.88%、20.06%和14.66%,四核苷酸及以上重复单元相对较少。选取并合成8对荧光引物进行PCR扩增,通过毛细管电泳检测发现,8对荧光引物共检测到60个多态位点,多态位点数平均为7.50,多态性信息含量(PIC)值变化范围为0.148 0~0.940 8,平均值为0.593 0。利用引物扩增带型组合法构建了石蒜属17个种资源的指纹图谱,其中引物QZ209可区分所有供试材料,并可用于杂交后代鉴定。本研究开发的SSR标记具有丰富的多态性,在石蒜属植物的资源多样性分析、杂交种鉴定及遗传图谱的构建应用中具有重要意义。     

利用分子标记辅助选择和花药培养改良光温敏不育系Y58S的稻瘟病抗性

Y58S是广泛应用的优良两系光温敏核不育系水稻品种。本研究通过分子标记辅助选择、花药培养与传统的回交技术相结合,将一全生育期广谱高抗稻瘟病基因R6导入Y58S,改良其稻瘟病抗性。根据改变激素的含量配制了4种诱导培养基,经比较发现激素配比为2,4-D3mg/L、KT1mg/L、NAA2mg/L的Y3培养基为Y58S背景材料花药培养的最佳培养基,其诱导率为15.08%,绿苗率为2.89%。本研究还获得1个含有R6基因的DH系,暂命名为YLH1,在远安自然诱发条件下稻瘟病抗性鉴定表明其分蘖期叶瘟抗性、抽穗期叶瘟抗性和穗颈瘟抗性均比对照Y58S显著提高。本研究表明花药培养和分子标记辅助选择相结合是改良光温敏核不育水稻稻瘟病抗性的快速、有效方法之一。     

利用Pigm基因改良粳稻保持系的稻瘟病抗性研究

选育和应用抗病品种是防治水稻稻瘟病经济有效的技术途径。为了改良粳稻保持系浙04B的稻瘟病抗性,以含稻瘟病广谱抗性基因Pigm的粳稻材料MP3为供体亲本,浙04B为受体亲本,通过杂交、回交并结合分子标记辅助选择,将Pigm基因导入浙04B中,利用分布于水稻12条染色体上的47个多态性SSR标记检测近等基因系的遗传背景回复率,获得了23份背景回复率0.80的近等基因系。选用4个浙江省稻瘟病优势菌株Zj-5、Zj-8、13-37和13-41人工接种鉴定,23份近等基因系均表现为抗穗颈瘟。田间自然诱发鉴定结果表明,23份近等基因系叶瘟为0级,穗瘟均为1级,表现为抗穗瘟,表明近等基因系稻瘟病抗性明显提高。对10项农艺性状的考察结果表明,导入Pigm基因的近等基因系剑叶变短,千粒重增加,生育期延迟,株高增加,有效穗数、每穗总粒数和产量总体减少。本研究结果为选育抗稻瘟病新品种提供了材料,同时为Pigm基因抗病育种应用提供了参考。     

小麦条锈病抗性基因定位及分子标记技术研究进展

条锈病流行对小麦生产造成巨大损失,选育和种植持久抗性品种是防治小麦条锈病最经济有效的策略。为达到多基因聚合培育持久抗病品种的目标,必须不断发掘抗病种质、解析其抗病遗传机制并开发分子标记。基于文献,对条锈病抗性基因发掘涉及的抗病性、分子标记、基因定位方法和定位进展及其在育种中的应用进行了综述,明确了小麦条锈病基因定位涉及技术的现状、局限性及优势,从而为后续的条锈病抗性基因发掘、多基因聚合和持久抗性小麦品种的选育与生产布局提供技术指导,以降低西北麦区和小麦主产区条锈病流行的频率,进一步促进国家粮食安全。     

一种基于HRM技术的安全及高通量水稻光敏不育基因分型体系的创建与应用

为建立适用于大规模应用功能性分子标记辅助选择(MAS)选育光周期敏感核雄性不育(PGMS)水稻的安全、高通量和廉价的光敏基因分型体系,本研究通过将基于竞争性扩增差异熔解扩增子(CADMA)的高分辨熔解曲线(HRM)分析与水稻基因组DNA快速提取方法相结合,创建了一种安全、廉价和高通量的PGMS基因分型体系。利用该基因分型体系,从约8 000株花培苗中检测出了2 027株PGMS水稻,并对117个DH_1光敏不育单株的DH_2材料进行跟踪检测,检出了异交单株。在该体系中,96个水稻材料的取样、DNA提取和PGMS基因分型可在2.5 h左右完成。从样本DNA提取到基因分型均不用有毒化学物质,所有操作均在基于96孔PCR板的操作平台进行,闭管操作、无交叉污染。本研究建立的PGMS基因分型体系必将极大提高水稻光敏不育系选育的效率。     

与大白菜TuMV抗病基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记开发

分子标记辅助选择可大大加快育种进程,然而由于大白菜抗病毒病遗传规律的复杂性,目前所定位的基因和筛选的连锁标记远不能满足育种需要,为了更好地对抗病毒病白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)进行分子标记辅助选择,本研究筛选了与大白菜抗芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记.本研究在对该基因进行定位的基础上,利用回交1代(backcross1,BC1)分离群体,采用分离群体分组分析法(bulked segregation analysis,BSA)、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)和序列特异引物(sequence specific primer,SSP)标记技术,筛选与该基因紧密连锁的分子标记.通过对13对SSP引物和16对SSR引物的分析表明,有8对引物在两亲本间表现多态性,有5对引物扩增出的标记与基因TuRBCS01紧密连锁或共分离,分别为mBr4072、Bra025493-1、Bra025493-2、Bra025467-4和Bra025467-5.筛选出与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记2个,分别为SAAS_mBr4072_240 (1.5 cM)和Bra025493-1(1.0 cM),另有3个标记与基因TuRBCS01共分离,分别为SAAS—Bra025493-2_749、SAAS_ Bra025467-4—780和SAAS—Bra025467-5_ 956.上述标记丰富了大白菜抗TuMV分子标记的数量和种类,有望用于大白菜抗病毒病分子标记辅助选择.     

中国南瓜果皮颜色基因连锁的SNP分子标记的开发及应用

为了解中国南瓜(Cucurbita moschata Duch.)果皮颜色性状的遗传规律,筛选与皮色性状紧密连锁的SNP分子标记,本试验以中国南瓜墨绿无斑果皮自交系CMO-1(P1)和浅绿有斑果皮自交系CMO-97(P2)为试验材料构建F_2遗传群体,对果皮颜色pc(pericarp color)基因进行遗传分析和基因定位研究,将定位区间内的SNP分子标记转化为dCAPS分子标记进行开发及应用。结果表明,浅绿有斑果皮对墨绿无斑果皮表现为显性,由1个显性单基因控制。此外,利用前期构建的高密度遗传图谱,在8号连锁群上检测到了1个与中国南瓜果皮颜色性状和斑纹性状连锁的基因位点,2个性状可能由同1个基因控制。将此基因定位在具有最高表型解释概率的标记R1_47757附近,两侧翼标记为R2_47028和R2_63809,遗传距离为1.86 c M,物理距离为145.13 kb。生物信息学分析表明,该区段存在32个预测候选基因。同时,根据检测到的与皮色性状相关基因位点内的SNP分子标记信息,设计dCAPS分子标记引物,经过PCR扩增及酶切验证,开发出2个扩增效率高、稳定性好的dCAPS分子标记,根据酶切带型可以准确的将F_2群体中的墨绿无斑表型和浅绿有斑表型区分开,且可以用于鉴定中国南瓜自交系材料的果皮颜色。本研究结果为南瓜果皮颜色的形成机理及开展南瓜分子标记辅助育种奠定了一定的理论基础。     

小麦SSCP分子标记体系的优化

SSCP技术易受上样缓冲液、变性的时间及温度、电泳条件等诸多因素的影响。本研究对上样缓冲液、变性的时间及温度、电泳条件等影响因素进行了研究,结果显示:上样缓冲液中不添加甘油、用量为PCR产物体积的1.5～3倍、变性温度98℃、变性时间10～15min、电泳缓冲液为0.5×TBE,常温下恒功率80W(2.67W/cm)电泳2 h左右,单链DNA条带清晰,易于识别。     

铁皮石斛EST-SSR分子标记的开发

为了开发铁皮石斛EST-SSR分子标记,利用SSRIT软件对铁皮石斛近缘物种-金钗石斛的15 383条EST序列进行SSR位点查找,利用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价,之后经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,并通过聚丙烯酰氨凝胶电泳对所筛选的引物进行有效性检测。结果表明,SSRIT软件共查找到370条SSR位点序列,共有379个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为2.46%。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占41.42%、26.91%和27.44%,其中二核苷酸重复中AG/CT(20.84%)和GA/TC(18.73%)最丰富;三核苷酸重复中TCT/AGA(4.22%)和GA/TC(3.96%)最丰富;而六核苷酸重复基元较多。EST-SSR平均长度为24 bp,平均每8.5条EST序列包含1个SSR位点。设计的106对EST-SSR引物中有50对能扩增出理想的PCR产物,引物有效扩增率为47.17%,其中有43对能够扩增出多态性条带,占可扩增引物的86%。本研究开发的43对引物为铁皮石斛遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建和功能基因研究等提供了重要的参考价值。     

位点特异性重组及其在剔除植物筛选标记基因中的应用

植物遗传转化中筛选标记基因的剔除是转基因植物商品化的一个重要因素,位点特异性重组可用于剔除筛选标记基因.常用的位点特异性重组系统主要有Cre/loxP、FLP/FRT和R/Rs系统.在应用中,可以通过二次转化或与含重组酶的转基因植株杂交来组成性表达重组酶,或利用瞬时表达、诱导性表达、组织特异性表达重组酶来剔除选择标记基因,从而获得无标记基因的转基因植株,而诱导性标记基因剔除最为有效.     

苦瓜AFLP分子标记反应体系的建立

利用AFLP分子标记技术,采用MseI/EcoRI酶切组合,从64对引物中筛选出6对带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物,分别为:E1/M5、E4/M8、E6/M4、E7/M5、E7/M7、E8/M3,并确定了适用于苦瓜AFLP反应的最佳酶切-连接、预扩增和选择性扩增反应体系,从而为今后利用AFLP分子标记技术对苦瓜进行深入研究打下基础。