多重PCR结合基因芯片技术检测5种猪繁殖障碍性病毒病方法的研究

为建立运用多重PCR和基因芯片技术同时检测5种猪繁殖障碍性病毒病的方法。本研究根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计特异性引物与探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了5种猪繁殖障碍性疾病病毒的标准毒株,并对16份临床样品进行检测。通过多重PCR扩增出带有荧光标记的5种病毒的特异性基因片段,并与固定有特异性探针的基因芯片杂交。结果显示,本研究建立的多重PCR结合基因芯片检测方法特异性强、稳定性好,灵敏度可达10~2拷贝/μL。16份临床样品检测结果显示阳性率达87.5%(14/16)。以上结果表明该方法特异性好、灵敏度高,可高效检测以上5种病毒,为其临床诊断及流行病学调查提供了有效的检测方法。     

应用多联PCR对引发猪繁殖障碍有关病毒的检测Ⅱ．JEV、PPV、PRRSV、PRV单项PCR检测方法的建立

在利用计算机设计出检测流行性乙型脑炎病毒（JEV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）的多联PCR引物的基础上，分别进行各单项PCR检测相应病毒试验，确定了各单项PCR反应条件范围，并对各PCR扩增产物进行了点杂交和部分测鉴定。用单项PCR对感染猪相关病毒的检测证实，本试验已经建立了有效、特异、敏感的检测JEV、PPV、PRRSV、PRV的单项PCR技术，为进一步建立多联PCR技术及其应用打下了基础。     

PCV2、PRV和PRRSV多重PCR方法的建立及其应用

根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、PCV2、PRRSV的多重PCR（mPCR）检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5（PRV）、25.2（PCV2）、35.9pg（PRRSV）。该方法对猪流感病毒（SIV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、大肠杆菌、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（TGE）等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,PCV2感染率为80%（160/200）,PRV感染率为21%（42/200）,PRRSV的感染率为78%（156/200）。200份临床样品主要为PCV2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%（112/200）。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。     

猪伪狂犬病、猪细小病毒病及猪流行性乙型脑炎多重PCR诊断方法的建立

根据Genbank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因序列，用Array Designer2．0软件设计并合成了PRV gB、PPV VP2、JEV C基因片段的3对引物，以PRV Fa株、PPV B2株、JEV SA14-14-2株细胞培养物提取棱酸人为混合后作为模板，筛选PCR反应条件，扩增出长度分别为324bp、471bp和238bp的3条特异性片段，建立了检测3种病毒的多重PCR方法。应用该方法对PRVFa、PRV渝A、8F20、BUK株、德国Bartha-K61株、PRV Ea株、PRV疫苗毒，PPV132株、PPV SR标准株SR-1、SR-2、SR-3，JEV SA14-14-2株的病毒核酸进行扩增，均获得了特异性的目的片段，而扩增PRRSV、CFSV、PCV-2及相应的培养细胞核酸结果均为阴性。对PRV Fa、PPV B2和JEV SA14-14-2的最低检出量分别为17．5pg、13．7pg和20pg的DNA或cDNA。该试验方法适合对PRV、PPV和JEV的联合检测和鉴别诊断。     

多重PCR诊断猪细小病毒、伪狂犬病毒和圆环病毒Ⅱ型方法的建立和应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等3种病毒基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV VP2、PRV gB、PCV2 ORF1基因的保守区为各病毒的诊断靶序列.在建立各病毒单重PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了三种病毒的多重PCR技术.用78份临床病料对本研究多重PCR技术和单重PCR技术进行对比验证,结果显示,总符合率为97.4%以上.该方法特异性强、敏感性高,为PPV、PRV和PCV2临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段.     

多重PCR检测CSFV和PRRSV与PCV2

根据GenBank上猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的已发表序列,分别设计并合成了3对特异性扩增引物,建立CSFV、PRRSV和PCV2单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466 bp、202 bp和706 bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了CSFV-PRRSV-PCV2多重PCR检测方法,为预防和控制上述三种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。     

JEV、PPV、PRRSV、PRV多联PCR的应用研究

用 JEV、PRRSV二联 PCR,PPV、PRV二联 PCR以及这 4种病毒 4联 PCR对来自内蒙、广州、广西、天津、北京、吉林病料进行检测 ,共检了 1 4 6份病料。其中 PRRSV阳性 7份 ,PPV阳性 1 2份 ,PRV阳性 2 1份 ,PRV和 PPV混合感染 4份。并对 5份人工接种 JEV小鼠病料检测 ,其中 4份为阳性。随后对部分阳性 PCR扩增产物进行点杂交和核苷酸测序鉴定 ,证实了 PCR扩增准确性。对内蒙 PRRSV阳性扩增带测序结果显示 ,我国流行 PRRSV为美洲型 ,在扩增片段的核苷酸序列上有 3个碱基差异     

猪主要DNA病毒多重二温式PCR检测方法的建立及初步应用

通过对GenBank发布的猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的核苷酸序列进行比对分析,找出PPV的VP2基因,PRV的gH基因和PCV2的ORF2基因的相对保守区域。利用生物学软件在保守序列分别设计高溶解温度引物,将常规三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,通过对PCR反应条件的优化,确定最佳引物浓度、最佳聚合酶浓度、最佳退火温度以及最佳反应体积,建立了多重二温式PCR方法检测PPV、PRV和PCV2,其扩增的目的片断大小分别为PPV(142 bp)、PRV(300 bp)和PCV2(469 bp),从而节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对PPV、PRV和PCV2 3种猪主要DNA病毒进行检测。用30份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为95%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有高度特异、快速、敏感等特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

应用多联PCR对引发猪繁殖障碍有关病毒的检测Ⅰ.JEV、PPV、PRRSV、PRV多联PCR引物设计

首先在ＧinＢank查出日本乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）、伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）、猪繁殖与 呼吸系统综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）和猪细小病毒（ＰＰＶ）基因组的所有已知序列,对各病毒基因区域进行同源性分析,结果各病毒基因组的结构特点,发现并确定了ＰＲＶ的gＨ基因区、ＪＥＶ的多聚蛋白基因区、ＰＲＲＳＶ的结构蛋白区和ＰＰＶ的ＶＰ２基因区为各自病毒保守序列。利用Ｇoldkey软件对上述保守的特殊序列进行引物设计,要求Ｇ＋Ｃ含量     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

液相芯片技术同时检测六种猪繁殖障碍病毒的方法研究

在GenBank中收集猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2基因、猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2序列、猪伪狂犬病毒(PRV)的gB基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的NSP2基因、猪瘟病毒(CSFV)的E2基因和乙型脑炎病毒(JEV)的M基因,利用Primer5.0等分子生物学软件对收集的序列分析比较,筛选出上述基因的特异保守序列并设计引物和探针,将设计好的探针与相应的微球偶联,优化条件,建立检测方法。结果表明:建立的检测PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的多重液相芯片技术具有较好的特异性、敏感性和稳定性,对PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的最低检出量分别为8.50×10~2copies/μL、2.87×10~2copies/μL、2.07×10~2copies/μL、2.61×10~2copies/μL、2.34×10~2copies/μL、2.05×10~2copies/μL,与相应病毒PCR/RT-PCR检测方法相比,敏感性提高了100~1000倍;对临床388份样品同步进行荧光PCR与液相芯片检测,结果99.87%相符。本方法为液相芯片技术在动物多病毒快速高通量检测、鉴别诊断等应用方面奠定了基础。     

猪主要繁殖障碍疾病病原的多重实时定量PCR快速检测

本研究旨在建立多重Real-time PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV).根据GenBank数据库中PRRSV、PCV2、PRV、和PPV的核苷酸序列设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,检测系列稀释的纯化阳性质粒,建立检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的单项和多重Real-time PCR方法.灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单项和多重Real-time PCR检测,该方法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对4种病毒的最低检测量为＜101拷贝或1 TCID50,检测灵敏度比常规PCR高100倍.对40份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果完全一致.建立的同时检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重Real-time PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点.     

3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157 ∶ H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌的TaqMan多重荧光定量PCR(qPCR)方法.针对大肠杆菌O157 ∶ H7 rfbE基因、沙门菌invA基因和产单核细胞李氏杆菌hlyA基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行...     

猪细小病毒病PCR检测方法的建立及应用

根据NCB I中登录的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,应用Prim er Prem ier 5.0软件设计一对引物,经反应条件优化,建立PPV的PCR检测方法。经特异性和敏感性测定,其最低检测值可达6×10-3ng/μl。采用PCR方法对118份临床样品进行应用检测,结果检测到6份为阳性样品。     

猪伪狂犬病PCR检测方法的建立与应用

根据Genbank中PRV gD基因序列设计引物建立了检测猪场狂犬病的PCR方法并对某省25份猪伪狂犬病疑似病料进行检测，结果在2S份病料中，检出伪狂犬阳性病料7份，阳性率接近30%。通过检测结果及特异性和敏感性实验发现此检测方法敏感度很高。这种检测方法适合科学研究、临床诊断以及流行病学调查。     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。     

CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

沙门菌多重PCR检测方法的建立及其应用

为鉴定临床上常见的3种沙门菌血清型,针对特异性基因invA(沙门菌属)、sdfl(肠炎沙门菌)、Stm4495(鼠伤寒沙门菌)和SPUL-2693(鸡白痢沙门菌)设计引物,利用标准菌株通过优化体系成功建立了沙门菌的四重PCR检测方法.结果 显示:该方法特异性好,敏感性高(检测下限:基因组为500 pg/mL,菌液为10...     

猪链球菌种及其主要致病血清型多重PCR检测方法的建立

根据猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因和血清型1型、2型、1/2型、7型、9型和14型的荚膜多糖编码基因核酸序列,分别设计猪链球菌种和血清型特异性引物,建立并优化多重PCR检测方法,检测分析种属背景明确的73株菌株（其中猪链球菌49株、其他对照菌株24株）及临床分离样本94株（包括四川资阳临床分离样本45株）。其中73株种属背景明确菌株多重PCR种检测结果符合率为87.5%,6种主要致病血清型检出率可达100%。24株对照菌株在种和血清型检测均为阴性。对45株四川猪链球菌病暴发现场分离菌株进行检测,其中41株为猪链球菌2型。上述结果提示建立的多重PCR方法对猪链球菌种及主要致病血清型的检测具有较好的特异性和敏感性,可用于猪链球菌病的快速诊断和流行病学调查。     

猪6种常见病毒多重PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的多重PCR检测方法。参考相关文献及序列比对结果设计6对特异性引物,建立了可同时检测以上6种病毒的多重PCR方法并应用此方法对临床病例进行了检测。结果表明,所建立的多重PCR方法灵敏度高,对6种病毒的最低核酸检测量分别为12.8pg(PRRSV)、46pg(CSFV)、16pg(PRV)、23.5pg(PCV-2)、72pg(PPV)、8.6pg(PCMV),对猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)无特异性扩增。应用该方法对临床145份样品进行检测,总阳性率为83.45%,2种以上病毒混合感染阳性率为69.66%。说明所建立的多重PCR检测方法敏感,可用于猪群中上述6种猪病病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。