紫色红曲霉FBKL3.0018产酯化酶的酶学性质研究

以从紫色红曲霉FBKL3.0018中固态发酵得到的粗酶制剂为研究对象,对该菌株的酯化酶酶学性质进行了较系统的研究。通过单因素实验确定该酶最适温度为40 ℃,在30 ℃条件下稳定性较好,最适pH值为6.5,在pH5.5～7.5条件下稳定性好。Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+对酯化酶酶活力有抑制作用,Ca2+在低浓度时有促进作用,高浓度时有抑制作用。K+对酯化酶酶活力有促进作用,并且随着K+浓度的升高,促进作用逐渐增强。吐温-80、十二烷基硫酸钠（SDS）、聚乙二醇6000、阿拉伯胶4种表面活性剂对酯化酶酶活力都有抑制作用。另外,甲醇和乙醇对该酯化酶酶活力有抑制作用,甲酸、乙酸、乳酸对酯化酶酶活力有促进作用。乙酸乙酯在低浓度时对酯化酶酶活力有抑制作用,含量为30%时反而有促进酶活力的作用。酯化酶最大反应速度Vmax为0.016 mol/（L·min）,米氏常数Km为0.015 4 mol/L。     

红曲霉酯酶酯化特性的探讨

酯酶是分解催化脂肪中酯键的酶类，具有水解或合成的能力，烟灰色红曲霉产生的酯酶活性较高。该文对1株烟灰色红曲霉所产酯酶进行了酯化特性的探讨，结果表明：该红曲霉酯酶的最适催化温度为40℃，最适催化酒精度为12％(v／v)，最适催化pH为3．0，且该红曲霉酯酶属于键专一性的生物酶。     

米曲霉As-W6脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

米曲霉As-W6的脂肪酶发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephadex G-75葡聚糖凝胶过滤层析纯化后得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为86.7倍,回收率为23.2%,相对分子质量为40.8 ku,酶学性质研究结果表明,该脂肪酶最适反应温度和最适p H分别为40℃和7,在40℃以下和p H6⁸之间有较好的稳定性;Ca2+、Mg2+和丙酮能够明显促进提高脂肪酶的活性,而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS对其有显著抑制作用;当大豆油作为底物时该脂肪酶的酶活力最高,表明其对大豆油具有显著的特异性。      

一株紫色红曲霉产红曲色素优化条件的研究

经筛选得到一株高产红曲色素的紫色红曲霉（Monascuspurpureus），本文研究了其最佳产素条件，认为该菌株具有发酵周期短、产色素水平高等优点。     

海参乙酰胆碱酯酶的酶学特性研究

对海参乙酰胆碱酯酶(AChE)粗酶的酶学性质进行研究.采用含0.1% Triton X-100 的PBS缓冲液(0.1 M,PH7.4)分别从海参肠和海参体壁中提取 AChE,配合Ellman法测定AChE酶活力.结果表明,海参肠与体壁 AChE 具有相似的酶学性质,其最适反应 pH 值为8.0,pH在6～8时稳定;最适反应温度为35℃左右,在25～45℃内热稳定性较好.海参乙酰胆碱酯酶粗酶液能有效水解碘化硫代乙酰胆碱(AcSChI),但对碘化硫代丁酰胆碱(BuSChI)的作用较弱.当底物AcSChI浓度大于50 mM时产生明显的底物过量抑制效应.金属离子 Sn<'2+>、Zn<'2+>、Hg<'2+>、Ag<'+>、Cr<'6+>、Cu<'2+>及毒扁豆碱和BW284c51均对海参肠和海参体壁乙酰胆碱酯酶有不同程度的抑制作用.     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺能够促进酶的活性,其中Ca²⁺激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。     

紫色红曲霉FBKL3.0018液态发酵产酯化酶的研究

以从中温大曲中筛选获得的紫色红曲霉FBKL3.0018为研究对象,并对该菌株液态发酵产酯化酶工艺条件进行优化。通过单因素试验、正交试验确定此菌株优化后的液态发酵的最佳培养基组成为5%麦芽糖、2%牛肉膏、0.04%硫酸镁,最高酶活力达到116.32 U/mL,较培养基优化前提高45%;最佳培养条件为接种量10%、培养温度32 ℃、培养时间5 d、摇床转速160 r/min,最高酶活力达到153.34 U/mL,较培养条件优化前提高32%。     

臭曲霉ZU-G1 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为明确臭曲霉ZU-G1分泌的α-半乳糖苷酶的酶学性质,采用硫酸铵沉淀、分子筛层析和阴离子交换层析等方法进行分离纯化.试验结果表明:α-半乳糖苷酶的分子质量136.71 kDa,反应最适pH 5.0,最适温度60℃;在30～40℃环境中热稳定性较好,在pH 6.0环境中酸碱稳定性较好.该酶受Ag+和十二烷基磺酸钠的强烈抑制(抑制率分别为100%和93%)、Cu2+的明显抑制,而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、棉籽糖、乙二胺四乙酸和巯基乙醇对酶活性影响较小.该酶对pNPG的米氏常数Km=33.48 mmol/L,最大反应速度Vmax=238.09 mmol/(L·min).本试验结果为α-半乳糖苷酶在饲料和食品中的应用提供了一定的理论基础.     

一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析

采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱等技术,从酱油大曲中纯化得到一种耐盐蛋白酶,经飞行时间质谱鉴定为钙蛋白酶RIM13,属于一种半胱氨酸蛋白酶。该蛋白酶的最适温度为50?℃;最适pH值为6.5;稳定温度为40?℃;稳定pH值为7.0;Mn2＋促进蛋白酶活力,Fe3＋、Fe2＋、Cu2＋、Ca2＋、K＋、Na＋抑制蛋白酶活力,以上金属离子对蛋白酶二级结构也产生不同程度的影响;米氏常数Km为2.43?g/L,最大反应速率Vm为103.09?mg/（L·min）。在5、10?g/100?mL和15?g/100?mL的NaCl质量浓度条件下,蛋白酶保留的酶活力分别为77.22%、54.39%以及41.15%。该蛋白酶在高盐度环境下保持较高的酶活力,因此具有潜在的工业应用价值。     

宇佐美曲霉阿魏酸酯酶A基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究通过RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆了编码阿魏酸酯酶A的成熟肽cDNA(AusfaeA),构建重组表达质粒pPIC9K-AusfaeA,将其经SacⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/AusfaeA,用甲醇诱导表达重组阿魏酸酯酶(reAusFaeA)。SDS-PAGE显示,纯化后的reAusFaeA为单一条带,其表观相对分子质量为36 000;以阿魏酸甲酯为底物,经高效液相色谱法测定,该酶的酶活为29.4 U/mg;reAusFaeA的最适反应温度为45℃,并在45℃以下稳定;最适反应pH为5.0,在pH 4.0~6.0范围内稳定;多数测定的金属离子及EDTA对该酶的活性影响不大。结果表明在P.pastoris中成功实现了AusfaeA的异源表达,该重组酶优良的酶学性质表明其具有较大的工业应用潜力。     

高产酯化酶红曲菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

该研究从研究室保藏的10株红曲霉菌株中筛选高产酯化酶菌株,通过分子生物学技术对其进行鉴定,并对其最适培养基进 行选择,最后对其所产的酯化酶酶学特性进行初步研究。结果表明,筛选获得一株高产酯化酶菌株X1,并被鉴定为血红红曲霉（Monascus sanguineus）。 其最适产酶培养基为可溶性淀粉70g/L,大豆蛋白胨20g/L,NaNO3 2 g/L,KH2PO4 1 g/L,MgSO4·7H2O 2g/L, 初始pH值4.5。采用最优培养基,在30℃、180 r/min条件下发酵4d,酯化酶活力为315.19 U/mL。 该酯化酶的最适反应温度为40℃,在 25～35℃范围内稳定性较好;最适pH值为5.0,在pH为6.0时稳定性较高;金属离子Ca2+可提高该酯化酶活性,Mg2+、Fe2+、Na+和Ag+则有 不同程度抑制作用,且Ag+抑制作用最明显。     

红曲霉产蛋白酶特性研究

通过对红曲蛋白酶活力的测定初步研究了红曲蛋白酶的特性。实验表明，红曲霉分泌蛋白酶的旺盛期在培养的第4d～6d。红曲蛋白酶的最适反应pH4．0～8．0，在pH5．0～6．0有较好的稳定性。红曲蛋白酶的最适反应温度在35℃-45℃，40℃时酶活力最大。红曲蛋白酶在35℃-40℃有较好的热稳定性。0．5％硫酸铜和0．5％醋酸铅对红曲蛋白酶有抑制作用，0．5％氯化钠对红曲蛋白酶则有激活作用。     

红曲霉产淀粉酶特性研究

通过对红曲淀粉酶活力的测定初步研究了红曲淀粉酶的特性。实验表明，淀粉酶分泌的旺盛期在培养的第4d-7d，红曲淀粉酶的最适反应温度55℃～65℃，在45℃～70℃有较好的热稳定性。最适反应pH5．0-6．0，在pH4．0～7．0有较好的稳定性。0.5％的Pb（NO3）2、CuSO4溶液对红曲淀粉酶有抑制作用，而0．5％的MgSO4、CaCl2、NaCl溶液对红曲淀粉酶有激活作用。     

紫色红曲霉固态发酵豆渣产红曲色素的工艺研究

探索了以紫色红曲霉(Monascus purpureus)固态发酵豆渣产红曲色素的可行性。从5种不同原料中筛选出豆渣为产红曲色素的最适固态发酵基质;在单因素实验的基础上,采用正交实验优化法得出紫色红曲霉固态发酵豆渣产红曲色素的最佳培养基组成为基质初始含水量50%、甘油6%、NaNO_30. 04%、KH_2PO_40. 3%、MgSO_40. 2%、抗坏血酸2. 2%,最佳培养条件为湿度60%～65%、接种量8%、30℃培养12 d,在此条件下红曲色素的含量为(6. 03±0. 11) mg/g。研究认为,以紫色红曲霉固态发酵豆渣产红曲色素的工艺可行,可实现豆渣的高值化发酵再利用。     

一株紫色红曲霉菌强化制曲的工艺优化

红曲霉菌的代谢产物和酯化酶等对促进白酒固态发酵过程中的风味和品质提高具有重要意义。为制备适合白酒酿造生产的酯化红曲,该研究对红曲霉菌进行液体培养,再分别以大米、麸皮及混合料等为原料进行纯种培养,选取种子液添加量、培养温度、培养时间和曲料含水率等作为影响因素,制备高酯化力的酯化红曲。结果表明,混合料明显优于大米或麸皮等单独作为原料制备酯化红曲,在培养温度35 ℃、培养时间3 d、曲料含水率55%、乳酸添加量4‰条件下,混合料成品酯化红曲的酯化力为716 mg/100 mL,糖化力为1 065 mg/（g·h）,发酵力为2.01 g/（0.5 g·72 h）,表明该菌株制备的酯化红曲具有较高的应用价值。     

红曲霉菌微胶囊化培养

采用NaCS PDMDAAC微胶囊对红曲霉菌进行了固定化培养试验 ,在进行连续 6批的培养中发现 ,红曲霉菌可以很好地在NaCS PDMDAAC微胶囊生长和产红曲色素。与游离培养细胞的比较表明 ,微囊化培养的糖耗时间会远远少于游离培养 ,红曲色素的浓度在前 3批略低于游离培养 ,一但达到稳定后 ,就会高于游离培养。同时也表明 ,微囊化培养时红曲霉菌的浓度远远大于游离培养。     

红曲霉菌胞外多糖的分离纯化、结构鉴定及抗氧化活性测定

目的:分离纯化红曲霉菌胞外多糖（Exopolysaccharide,EPS）,测定各组分的抗氧化活性并对其结构进行初步表征。方法:红曲霉菌发酵液经乙醇沉淀获得胞外多糖,经精制除杂和DEAE-纤维素柱层析法分离纯化获得多糖组分,再分别用高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）、柱前衍生PMP-HPLC法测定相对分子质量（Mw）和单糖组成,测定多糖组分清除DPPH和羟自由基的能力,评价其体外抗氧化活性。结果:EPS经分离得到三个组分EPS-1、EPS-2和EPS-3,相对分子质量分别为8673、143537、238742 Da。EPS-1、EPS-2均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖组成,摩尔比为1∶0.301∶2.052∶3.614和1∶2.475∶1.950∶1.532,EPS-3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成,摩尔比为1∶0.401∶0.066∶0.307∶2.974。三个多糖组分对DPPH·和羟自由基均有清除能力,并与多糖浓度呈现正相关。当多糖浓度为1 mg/m L时,三个组分对DPPH清除率分别为16.4%、15.9%和14.8%;对清除羟自由基的清除率分别为40.4%、39.6%、63.8%。结论:红曲霉菌胞外多糖各组分的相对分子质量和单糖组成比例均有差异;对羟自由基、DPPH·的清除作用也存在差异,这种活性差异可能与各组分Mw及结构差异相关。      

精氨酸等物质对紫色红曲菌产Monacolin K及红曲色素的影响

基于前期的非靶向代谢组学研究结果,在红曲菌发酵液原有营养成分的基础上添加精氨酸、L-苹果酸、D-葡萄糖、烟酰胺、α-酮戊二酸、苯丙氨酸、赖氨酸、焦磷酸硫胺素、黄素单核苷酸、L-乳酸等差异代谢物,对发酵第8天和第15天的红曲色素以及Monacolin K的产量进行了分析。结果表明:精氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及黄素单核苷酸的添加对Monacolin K产量的提高效果较好,推测氨基酸类物质的添加对Monacolin K产量有促进效果;其中精氨酸添加后效果最为显著,Monacolin K产量约为对照组的2.2~3.7倍。不同含量的烟酰胺对Monacolin K有不同的影响,低含量具有促进作用;而高含量则表现为抑制作用。赖氨酸、苯丙氨酸以及黄素单核苷酸对红曲色素提升效果较好,其中黄素单核苷酸可使红曲色素产量约提高至对照组的1.5~3.0倍。     

红曲发酵过程中杂菌污染原因分析

目的查找红曲霉菌发酵过程中出现大面积污染造成发酵产量、含量严重下降的原因。方法随机对照分组实验,对实验数据结果作对比分析判断。结果由菌种造成的污染率约为4.31%;由接种操作造成的污染率约为1.76%。结论菌种不纯、接种操作不规范是造成污染的主要原因。