草莓中诺如病毒和甲肝病毒的多重实时荧光逆转录PCR检测方法的建立

目的建立草莓中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒等3种食源性病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品检测。方法对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA提取和纯化后,先采用单重实时荧光RT-PCR进行检测,随后进行多重实时荧光RT-PCR反应条件优化,建立多重实时荧光RT-PCR检测方法并分析其特异性和灵敏度。结果所采用的病毒富集和核酸提取方法可以实现病毒的有效富集和抑制剂的去除,建立的多重实时荧光RT-PCR方法特异性强(100%),对草莓样品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的检测灵敏度分别为56.2 RT-PCR50/20 g、31.6 RT-PCR50/20 g和31.4 CCID50/20 g。同时对50份样品进行检测,结果均为阴性。结论所建立的检测方法快速、灵敏、特异性强,适用于草莓产品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的同时检测。     

GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立快速准确的GⅡ型诺如病毒定量检测方法,本研究将微滴式数字RT-PCR技术应用于GⅡ型诺如病毒检测中,并与实时荧光RT-PCR法进行了比对。微滴式数字RT-PCR反应退火温度的优化实验确定了其最佳退火温度为56℃,实时荧光RT-PCR和微滴式数字RT-PCR两种方法的灵敏度实验对比表明微滴式数字RT-PCR法检测GⅡ型诺如病毒的灵敏度为5.40 copies/μL,其灵敏度高于实时荧光RT-PCR法,重复性实验对比表明两种方法在检测中间浓度的GⅡ型诺如病毒时重复性均较好;人工污染西生菜实验中表明微滴式数字RT-PCR法最低检测限为54.00 copies/μL。本研究建立的GⅡ型诺如病毒的微滴式RT-PCR检测方法,灵敏度高,重复性良好,在人工污染西生菜GⅡ型诺如病毒的检测中表现理想,具有良好的应用前景。     

检测鲜草莓中GⅡ型诺如病毒的两种富集方法比较

目的建立鲜草莓中GⅡ型诺如病毒(No V GⅡ)的实时荧光RT-PCR检测方法,评价磁珠富集法和PEG(聚乙二醇)沉淀法对检测草莓中No V GⅡ的适用性,对北京地区采集的18份草莓样品进行检测。方法参照ISO/TS 15216-1《实时荧光RT-PCR方法测定食品中甲型肝炎病毒和诺如病毒水平方法》合成检测No V GⅡ的特异性引物和探针,分别采用磁珠富集法和PEG沉淀法富集病毒,然后提取RNA,建立实时荧光RT-PCR检测方法,并对提取条件进行优化。结果磁珠富集法的最高回收率为1.730%(PBS缓冲液),PEG沉淀法的最高回收率为1.682%(TGBE缓冲液),18份草莓样品均未检出No V GⅡ。结论通过磁珠富集法和PEG沉淀法建立的病毒检测的富集方法均适用于鲜草莓中No V GⅡ的检测。     

北极苹果结构特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法建立

目的为实现转基因北极苹果(Arctic~(TM) apple)目的标识管理,建立特异性实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法针对转基因北极苹果特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因北极苹果实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因北极苹果实时荧光PCR特异性强,定量检测限为20拷贝,扩增效率为96%,检测重复性良好。结论建立的特异性实时荧光PCR法可应用于转基因北极苹果的鉴定。     

西生菜中低污染量GⅡ型诺如病毒的富集与定量检测研究

目的优化新鲜西生菜中低污染量的GⅡ型诺如病毒富集方法,比较实时荧光RT-PCR与微滴式数字RT-PCR检测方法,研究适用于新鲜西生菜中低污染量的GⅡ型诺如病毒的定量检测方法。方法选取洗脱液种类、沉淀剂种类、沉淀剂作用温度及沉淀剂作用时间4个因素进行研究,以确定较优的GⅡ型诺如病毒富集条件。结合较优的富集条件,分别采用实时荧光RT-PCR方法和微滴式数字RT-PCR方法进行定量检测。结果病毒富集方法研究表明:洗脱液为牛肉膏-甘氨酸洗脱液、沉淀剂为PEG6000+PEG8000、沉淀剂作用温度为4℃,沉淀剂作用时间为4 h为较优条件,此时富集后的平均病毒浓度最高,平均回收率可达53.43%。实时荧光RT-PCR的检测限为1.44×10~4 copies/g;而微滴式数字RT-PCR的检测限为7.86×10~2 copies/g。结论通过优化西生菜中低污染量的GⅡ诺如病毒富集方法,比较实时荧光RT-PCR方法与微滴式数字RT-PCR方法定量检测病毒的效果,建立了适用于西生菜样品中低污染量GⅡ诺如病毒的定量检测方法。     

转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

目的实现转基因鲑鱼AquAdvantage的标识管理,建立其品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。方法针对转基因鲑鱼的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因鲑鱼实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因鲑鱼实时荧光PCR方法特异性强,在600 000~60拷贝范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为y=-3.2194x+40.805,R~2=0.997,检测限为60拷贝,检测重复性良好。结论建立的品系特异性实时荧光PCR方法可应用于转基因鲑鱼AquAdvantage的鉴定。     

实时荧光聚合酶链式反应检测肉制品中的鸭源性成分

通过鸭的肌动蛋白β-actin保守基因设计可特异检测鸭肉成分的引物和探针,建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测鸭肉的方法,并通过模拟肉样和市售样品检测方法的准确性和适用性。结果表明：该方法可以特异性检测出麻鸭和草鸭成分,而对猪、牛、羊、鸡等DNA均没有扩增,检测灵敏度可达到1 pg DNA;通过模拟肉样检测确定最低质量分数检测限为0.01%;市售样品的检测结果表明,该方法能很好地应用于市场,满足市场检测需求。     

北京市市售牡蛎中诺如病毒核酸检测及定量分析

目的针对北京市市售牡蛎样品中诺如病毒污染水平及污染浓度进行定量分析研究。方法分离牡蛎消化腺,将消化腺匀浆处理,加入含有蛋白酶K的磷酸盐缓冲液,进行样品前处理,用试剂盒提取病毒RNA,用一步法实时荧光逆转录聚合酶链式反应(real time RT-PCR)检测诺如病毒RNA,并对阳性样品进行定量分析。结果共检测牡蛎样品356份,其中GGI阳性样品12份,GGII阳性样品39份,GGI和GGII同时为阳性的样品6份。对阳性样品中的诺如病毒核酸定量分析,核酸浓度在3.7×10~3~2.8×10~5基因拷贝/g(消化腺)之间。结论北京市市售牡蛎中存在诺如病毒污染的情况,需要加强对牡蛎中诺如病毒的污染监测,并开展污染水平风险评估,保障消费者食用安全,降低由诺如病毒引起的腹泻病的疾病负担。     

转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法建立

目的 为实现转基因甜菜GTSB77的标识管理,建立其品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。方法 针对GTSB77的3′端外源插入片段与甜菜基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果 建立的GTSB77检测方法特异性强,定量限(LOQ)为16拷贝,扩增效率为102%,重复性测试结果相对标准偏差(RSD)介于0.21%～1.66%之间。结论 建立的实时荧光PCR方法可应用于GTSB77的鉴定检测。     

三七染料法实时荧光聚合酶链式反应鉴别方法的建立

目的 采用TB Green染料法实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术,基于叶绿体基因psbA-trnH序列建立鉴别三七的实时荧光PCR方法。方法 通过比较三七及其同属的人参、西洋参和竹节参的psbA-trnH序列,设计出一对三七特异性引物,优化退火温度,进行灵敏度实验,并验证方法的特异性、适用性和抗干扰性,最后对市售三七样品进行检测。同时以18SrDNA引物为内参质控,对DNA提取及反应体系进行质控。结果 所建立的三七染料法实时荧光PCR方法灵敏度为0.001 ng/μL;特异性较好,与18种近缘及常见中药材均无交叉反应;适用性和抗干扰性也较好;对28份不同加工方式的市售三七样品检测的结果与测序结果一致。结论 建立的三七染料法实时荧光PCR方法具有快速、准确、灵敏的特点,可用于三七产品中三七成分的鉴别。     

实时荧光RT-PCR检测冷冻草莓中诺如病毒

目的：建立冷冻草莓中的GI、GII型诺如病毒实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品的检测。方法：对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA的提取和纯化,然后采用实时荧光RT-PCR进行检测。结果：核酸提取方法能够有效地去除抑制因子,同时对104份送检样品进行检测,结果均为阴性。结论：所建立的核酸提取与实时荧光RT-PCR结合的检测体系适合于草莓样品中诺如病毒GI、GII型的检测。     

微滴式数字PCR检测冷冻草莓中GⅠ、GⅡ型诺如病毒

目的:建立一种检测冷冻草莓中诺如病毒(GⅠ和GⅡ)的逆转录微滴数字PCR (RT-ddPCR)方法。方法:根据ISO标准选定检测引物,优化反应体系,退火温度,进行了方法学实验,建立了一种快速检测冷冻草莓中GⅠ和GⅡ亚型诺如病毒的新方法。结果:确定了数字PCR检测GⅠ型诺如病毒退火温度为56.5℃,GⅡ型诺如病毒退火温度为58.1℃。RT-ddPCR检测GⅠ质粒标准品标准曲线的R²=0.9947,RT-ddPCR检测GⅡ质粒标准品标准曲线的R²=0.9950,说明该方法具有良好的线性关系。与RT-qPCR灵敏度对比,RT-ddPCR法的灵敏度比RT-qPCR法高一个数量级。在检测范围内,最低检测限低至个位拷贝数。RSD最小为3.8%,表明该实验重复性良好。浓度较低100 copies/μL左右时,RT-ddPCR的重复性不佳。结论:本研究建立的诺如病毒数字PCR法具有特异性强、灵敏度高、检测限低等优点,可用于冷冻草莓中诺如病毒的定量检测。     

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猫源性成分

根据猫线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原酶亚基1（ND1）基因中的保守序列设计猫特异性引物和TaqMan探针,建立食品中猫源性成分的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。通过实时荧光PCR反复验证,结果表明,引物和TaqMan探针对猫源性成分的特异性良好,检测灵敏度可达1 pg,适用于食品中猫源性成分的快速鉴定。通过对随机抽取的市售肉制品的检测,尚未发现掺有猫源性成分的行为。     

同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分实时荧光聚合酶链式反应方法的建立及应用

以鸡转化生长因子β-3(transforming growth factor beta-3,TGFB3)基因、猪朊蛋白(prion protein,PRNP)基因和鸭、牛生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,设计合成特异性引物和TaqMan探针,通过对实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系和反应条件的优化,建立同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:本研究所建立的方法只在鸡、鸭、猪或牛源性成分存在时才产生特异性扩增曲线,表明该方法具有良好的特异性;且对鸡、鸭、猪和牛源性成分的最低检测质量浓度分别可达到10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL,具有良好的灵敏性;应用建立的检测方法对市售34份速冻食品鸡、鸭、猪和牛源性成分进行同时检测,能够实现对速冻食品中4种动物源性成分的有效检测,进一步分析发现,15份速冻食品源性成分测定结果与外包装标注成分不一致。本研究所建立的同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏性,且操作简单、适用范围广,能够满足日常检测需求。     

福建省养殖环节牡蛎中诺如病毒污染状况分析

目的 了解福建省养殖环节牡蛎中诺如病毒(Norovirus)污染状况及基因分型,进一步定量分析诺如病毒污染水平,为食品中诺如病毒污染监测及安全风险评估提供数据支持.方法 2017年8月—2018年9月,于福建省某养殖基地采集牡蛎样品共244份,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法对样品中诺如病毒进行检测,确定其污...