刚地弓形虫P30(SAG1)重组抗原的高效表达和体外纯化(英文)

目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础。方法PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+)构建重组载体,将其转化到DH5α中。经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。大量的诱导表达产物用SNBC3S NTA Resin方法纯化并进行复性。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组表达融合蛋白量单位为30ku,与理论值相符。结论成功构建重组体,获得纯化和复性的弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

刚地弓形虫P30(SAG1)基因的克隆与表达

目的构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和HindⅢ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5α中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行鉴定。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku,与理论值相符。Westernblot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

刚地弓形虫P30（SAGl）基因的克隆与表达

目的 构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法 将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增，NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切后，与同样酶切的表达质粒pET-30a( )经T4连接酶连接，然后转化到DH5a中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后，将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，表达产物用SDSPAGE和Western blot进行鉴定。结果 扩增的P30基因片段为750bp，重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku，与理论值相符。Western blot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论 成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗对BALB／c小鼠免疫保护性的研究

目的用刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠观察对机体的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗奠定基础。方法PCR方法从刚地弓形虫基因组中扩增出ROP2和P30片段,将这两个片段分别亚克隆至pET-30a原核表达载体中,表达出ROP2-P30复合重组蛋白。用蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫小鼠后体液中抗体和细胞因子的变化,观察攻击试验小鼠的的死亡率。结果ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生大量的IgM、IgG抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。攻击试验表明,复合重组蛋白免疫组和对照组相比,小鼠的存活时间明显延长。结论ROP2-P30复合重组蛋白免疫BALB/c小鼠诱导其产生高水平的体液和细胞免疫应答,该复合重组蛋白是抗刚地弓形虫感染的候选疫苗之一。     

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达

目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2（ROP2）和主要表面抗原1的重组表达质粒，纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段，分别克隆人pMDl8-T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应，亚克隆入pET-30a（＋）原核表达载体，构建pET-ROP2载体，然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a（＋）载体连接，经含卡那霉素的LB平板筛选，酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后，用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段，成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体，获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

目的构建含弓形虫主要表面抗原P30与致密颗粒蛋白ROP2复合基因重组质粒,并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-ROP2;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌大量摇瓶表达,纯化产物,免疫活性鉴定。结果获得pGAPZαA-P30-ROP2重组表达载体,SDS-PAGE和Western Blot结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kD,具有一定的免疫活性。结论弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中成功分泌表达,表达产物具有免疫活性,为弓形虫病诊断抗原及疫苗研制奠定基础。     

弓形虫主要表面抗原P30基因的原核融合表达及鉴定

目的在已建 P30克隆载体的基础上,进一步构建表达质粒,诱导以融合蛋白形式表达的能被免疫血清识别的 P30蛋白,并探索最佳表达条件。方法双酶切 P30克隆载体和空白表达质粒 PGEX-4T-1,连接后转化入 DH5α进行 PCR 筛选,酶切鉴定和测序验证。重新将重组质粒转化入表达宿主菌 BL21进行诱导。对比不同诱导时间的菌体蛋白 PAGE 图谱,并进行 Western blot鉴定。改变诱导物浓度和培养温度,优化出最佳表达条件。结果构建成功序列和读框正确的重组质粒并表达出特异性 P30抗原,该抗原能被抗弓形虫蛋白血清识别。表达产量在 IPTG 为0.1mM时较高,而培养温度影响不大。结论表达出的具有免疫原性的重组蛋白,经纯化和切割后,可为研究 P30在虫体入侵,诱发机体免疫反应中的作用及疫苗和诊断试剂的开发提供充足的条件。     

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建

目的构建刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）棒状体蛋白11（ROP11）的真核表达重组质粒行在真饮细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RTPCR方法扩增ROP11基因并克隆至真干发表达质粕pcDNA3．1（＋）,构建重组表达质粒pcDNA3．1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果RT—PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3．1-ROP11经PCR及EcoRI和NotI双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核什酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99％。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达日的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

刚地弓形虫强毒株棒状蛋白ROP18的克隆、表达和免疫反应性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫棒状体蛋白ROP18基因(TgROP18),并分析其免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,PCR扩增TgROP18基因。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pET30a(+),重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性菌落加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白TgROP18的表达情况。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blot-ting)分析该重组蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增获得TgROP18基因,长约1 665 bp,编码554个氨基酸,其中前47个氨基酸构成信号肽序列。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgROP18构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)为59 800的可溶性重组蛋白TgROP18。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白可被鼠抗刚地弓形虫的血清识别。结论重组蛋白TgROP18具有一定的免疫反应性。     

弓形虫棒状体蛋白ROP2基因的克隆与表达

目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段，克隆至表达载体pET22b中，导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段，克隆至质粒pUC119中，经PCR和酶切鉴定后，进行DNA序列测定，并以SacⅠ／HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上，重组质粒pET22b—ROP2转化大肠杆菌BL21，CodonPlus（DE3）-RIL菌株中，经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1．0kb的ROP2基因片段．构建成功重组质粒pUC119，ROP2，经DNA序列分析与已报道序列基本一致，重组质粒pET22b，ROP2在大肠杆菌中表达，产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达，构建成功的重组盾粒pUC119-ROP2可用千下一步多基因融合的市隆操作。     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1融合基因的克隆与表达

目的 进行弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合基因的克隆与表达，为弓形虫ROP2?鄄P30基因工程复合抗原的制备做准备。 方法 半套式PCR扩增编码弓形虫P30的基因片段，克隆至已构建成功的重组质粒pUC119/ROP2中，经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒pUC119/ROP2-P30再以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET28b上，鉴定正确的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌表达菌株BL21-Codon Plus（DE3）-RIL，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。 结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出700 bp P30基因片段，成功构建重组质粒pET28b/ROP2-P30，该质粒经PCR和酶切鉴定，与预期结果一致，并在大肠埃希菌中高效表达，产生相对分子质量（Mr）约为 69 000的重组目的蛋白。 结论 弓形虫ROP2和P301融合基因克隆成功，并表达出预期的复合重组蛋白ROP2-P30。     

弓形虫ROP2-P30重组真核表达质粒的构建及其免疫效应的初步分析

目的构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合的重组真核表达质粒,观察融合抗原ROP2-P30以DNA免疫方式在体内的免疫学效应。方法以重组质粒pET28b/ROP2-P30为模板,利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30,经PCR和酶切鉴定正确后,体外转染COS-7细胞,Westernblot检测ROP2-P30表达。重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30以每鼠100μg混合透明质酸酶10U的剂量肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,以弓形虫虫体裂解抗原作包被抗原,ELISA法测定免疫小鼠血清IgG抗体,免疫结束2周后,以约100个弓形虫速殖子攻击感染小鼠,观察小鼠生存状况。结果PCR和酶切鉴定表明重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建正确;Westernblot显示该重组质粒在COS-7细胞中瞬时表达的产物可被重组ROP2-P30免疫兔血清识别;ELISA检测重组质粒免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平升高;重组质粒免疫小鼠感染弓形虫后的存活时间较对照组有所延长。结论重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建成功,用该重组质粒DNA直接免疫小鼠,能够诱导产生特异的体液免疫反应,具有一定的免疫保护性;该重组质粒表达的融合抗原分子ROP2-P30具有免疫原性,可作为疫苗候选抗原深入研究。     

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法　将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。     

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的 研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。 方法 42只BALB/c小鼠随机分为3组：实验组、空质粒组和PBS对照组，各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50 μg、pc-DNA3空质粒50 μg和PBS 50 μl，共免疫3次，每次间隔3周，末次接种量均加倍。末次免疫后2周，各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织，检测CD4⁺、CD8⁺ 及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个，观察其存活时间等。 结果 ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应，小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原；实验组小鼠的CD4⁺T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+ 比值显著升高(4.69±1.32)%（P<0.01）；其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）均有不同程度的升高，尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180 h后，实验组小鼠免疫保护率为88.9%，与对照组相比，小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟（P<0.01）。 结论 ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性，能产生良好的免疫保护作用。     

弓形虫RH株膜蛋白P30的原核表达与鉴定

目的在E.coli中表达弓形虫RH株膜蛋白P30。方法将P30基因定向克隆到pET28b,构建含目的基因的pET28b-P30重组质粒,转化E.coliBL21(DE3),接种含pET28b-P30的BL21(DE3)单菌落于LB培养基,1∶100稀释后用0.2mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定诱导表达产物。结果1构建了重组质粒pET28b-P30,2在E.coli中表达了一分子量约为30kDa的融合蛋白,经Westernblot鉴定正确。结论在E.coli中高效表达了弓形虫RH株膜蛋白P30,并以包涵体形式存在。     

弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达

目的　扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法　设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果　从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论　GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。