Bt抗虫基因在作物中的应用

基因工程是现代生物技术在生物农药研制方面的重要手段之一,其中以苏云金芽芽孢菌（Bt）杀虫蛋白为基础的转基因作物是该类研究的热点。由于转Bt基因作物在抗虫、减少化学污染方面的良好性能,玉米、棉花等转基因作物已在世界范围内商业化。我国转Bt基因作物研究起步晚,但发展迅速。目前已先后批准了甜椒、番茄以及番木瓜3种作物作为商业化生产。与此同时,Bt转基因作物在基因漂移、抗虫性以及生物安全性方面存在争论,需要更多的实验支持和更深入细致的研究。     

转Bt基因水稻种子中Bt蛋白含量测定方法的研究

采用ELISA技术检测转Bt基因水稻中Bt蛋白的含量,判断水稻样品中是否含有转基因成分。利用研磨、酶标、孵育等技术对样品进行前处理。采用阳性质控物浓度等倍稀释方法,建立标准曲线,相关系数为0.997 4。用一系列不同转基因含量的标准基体材料,分析方法的最低检测限,灵敏度达0.1%。通过对我国进入生产性试验的转Bt基因水稻品系TT51-1和科丰6号的测试,表明该方法与普通PCR方法真实性和灵敏度一致,可以广泛应用于转Bt基因水稻及其粗加工产品的转基因成分检测。为转基因生物安全监管和安全性评价提供技术支撑。     

利用PCR方法检测转BT基因水稻

应用PCR技术进行转基因水稻检测研究。本文以转基因水稻为材料，以聚合酶链式反应（PCR）方法为基础，选择适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术，针对转基因水稻中普遍存在的花椰菜花叶病毒（CaMV35S）启动子、胭脂碱合成酶（NOS）终止子、和转入苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简写为Bt）基因水稻的CrylAc片段进行PCR检测，建立适合转BT基因水稻的检测方法。该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符。     

转基因水稻Bt63的外源基因相对含量分析

为分析转基因Bt63稻米外源基因含量,利用新型、灵敏和高通量的实时荧光定量PCR技术,以RBE-4作为转基因水稻的内源参照基因,通过梯度稀释法,分别获得了Bt 63和RBE-4基因的Ct值与起始模板相关性的标准曲线,相关系数分别为0.996 6和0.995 4。通过转基因水稻外源基因(Bt63)和内标基因(RBE-4)起始模板数的比较,测定了外源基因在转基因水稻中的相对含量,这项研究将为建立转基因水稻抗虫能力评价体系和转基因稻谷的流通和监管提供技术支撑。     

转基因水稻重获安全证书

<正>近日,华中农业大学生命科学技术学院官方网站发布消息证实,该校水稻团队研发的两种转基因抗虫水稻再次获得由农业部颁发的农业转基因生物安全证书(生产应用)。该安全证书的有效期为五年,自2014年12月11日至2019年12月11日。据了解,这两种转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻:"华恢1号"和"Bt汕优63"是目前中国获得安全证书的仅有的两种转基因主粮。曾于2009年8月获得过安全证书,但于2014年8月17日到期后失效。     

抗虫棉花

经过多年的攻关,我国科学家成功地完成了杀虫蛋白基因BtCryLA的人工合成,并于1994年获得了高抗棉铃虫的转基因棉花植株,转基因抗虫棉核心技术“编码杀虫蛋白质融合基因和表达载体及其应用”获得国家发明专利（专利号:ZL 95　119563.8）,使我国成为继美国之后拥有自主知识产权,独立研制成功转基因抗虫棉的第二个国家。导入Bt基因和CpTI（豇豆胰蛋白抑制剂）基因双价转基因抗虫棉花以及抗真菌病转基因抗病棉花等一系列转基因抗虫,抗病棉花品系也相继研究成功。     

储藏期内转Bt基因稻谷对印度谷螟生长发育的影响（网络首发、推荐阅读）

对转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（华恢1号）及其非转基因亲本明恢63在储藏期内对害虫印度谷螟生长发育的影响开展研究。结果表明，转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷对印度谷螟低龄幼虫（1至3龄幼虫）具有较强的致死作用。温度显著影响印度谷螟各虫态的发育历期和发育速度，以2%转基因稻谷糙米粉饲喂印度谷螟后发育历期显著延长。种群生长发育速率与温度关系的非线性拟合结果显示，印度谷螟发育起点温度为7.40~15.94 ℃，以2%转基因稻谷糙米粉饲喂印度谷螟发育起点温度为4.90~17.36 ℃。以上研究结果在理论上加深对转Bt基因稻谷生态安全的认识，在实践上为科学开发利用转Bt基因水稻提供理论支持。     

转Bt玉米暴露对亲代及子代大鼠免疫细胞分型及细胞因子的影响

为研究转苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)基因抗虫玉米长期食用对大鼠免疫的影响,以其亲本非转基因玉米饲料及商业饲料为对照,分别采用流式细胞术及液相芯片法检测喂养90 d后亲代及子代刚断乳大鼠外周血、脾脏免疫细胞分型及相关血清细胞因子的表达。结果发现,转Bt基因抗虫玉米饲料组亲代大鼠外周血和脾脏及子代脾脏各淋巴细胞亚群(CD4~+、CD8~+、TCRαβ~+、TCRγδ~+)的细胞数量比例及亲代血清中10种细胞因子表达水平均与非转基因玉米饲料组无显著差异(P0.05);子代外周血B淋巴细胞数量比例显著增高,巨噬细胞炎症蛋白-1α、单核细胞趋化因子-1β、白细胞介素-5表达水平明显降低(P0.05)。结果表明:转Bt基因抗虫玉米暴露90 d对亲代大鼠免疫系统影响不大;对子代刚断乳大鼠的细胞免疫及体液免疫有一定的影响。     

Bt蛋白免疫检测技术研究进展

在商用转基因大豆、玉米中,转Bt基因占绝大多数,由于目前越来越多的国家要求对转基因产品实行标签制度,因此转Bt基因成分的快速检测对进口转基因国显得非常重要,本文对Bt蛋白的一种快速检测技术-免疫检测技术的研究进展进行综述。     

应用简并PCR方法检测转cry1A基因作物

根据不同转基因作物中cry1A基因的保守区序列,建立简并聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）对转cry1A基因作物检测方法。cry1A基因（包括cry1Ab、cry1Ac、cry1Ab/Ac、cry1A.105、mcry1Ac）是抗虫转基因作物中使用频次最高的目的基因,常用作转基因成分筛选检测的靶标。应用Vector NTI Advance 11.5软件将已报道的20余种cry1A基因PCR检测方法中的引物与11 个cry1A基因序列进行比对,结果显示,这些方法的引物序列不能同时与所有cry1A基因序列完全配对,每对引物的错配碱基数均大于3 个,且许多错配发生在引物的3’端,表明这些cry1A基因检测方法理论上仅适用于部分特定的靶标基因。在对MON810、Bt11、Bt176等11 种转基因作物中cry1A基因核苷酸序列进行比对分析基础上,以其5’端的保守核苷酸序列为模板,筛选到1 对简并引物,建立了cry1A基因的简并PCR方法。应用该方法能特异性地检测11种转基因作物中的cry1A基因,检测灵敏度可稳定达到0.1%。该方法为转基因作物中cry1A基因的高效筛选检测提供了一种新的技术手段。     

转Cry1Ab/Cry1Ac基因大米粉饲喂印度谷螟后的比较转录组分析（网络首发、推荐阅读）

转Cry1Ab/Cry1Ac基因作物可以有效防治害虫。以世界性的储粮害虫印度谷螟Plodia interpunctella (Hübener)为研究对象,借助高通量测序法研究试虫中与Bt毒蛋白密切相关的基因,以期初步揭示转Bt稻谷的杀虫作用机制。结果表明,在对印度谷螟非胁迫种群和转Bt基因大米粉胁迫种群分别进行转录组测序,经De novo组装后共得到37 246个Unigene,其中有23 310个Unigene获得注释。随后,通过比较分析上述两种品系试虫基因表达量,共筛选出34 466条显著差异表达的基因,其中在胁迫品系中有15 741条基因表达量显著上调,另有18 725条基因表达量显著下调。一方面大大扩充了针对该物种的基因信息,另一方面为转基因稻谷抗印度谷螟的相关机理研究提供了新思路。     

应用多重PCR技术筛选检测转Bt基因作物

Bt基因在抗虫转基因作物中广泛应用,是转基因食品筛选检测中最主要的目的基因。本研究依据核苷酸序列分析结果,将在转基因作物中常见的8种Bt基因(cry1Ab、cry1Ac、cry1Ab/Ac、cry1A.105、cry1Ac-M、cry2Ab、cry3A和cry3Bb)划分为cry1A、cry2A、cry3A三个组,并根据每个组的一致性序列设计了可分别检测各组Bt基因的特异性检测引物,其中cry1A组采用了简并引物,经过特异性、灵敏度等测试,建立了针对cry1A组、cry2A组和cry3A组的单一PCR检测方法。此外,通过将这三对检测引物放入同一PCR体系中,还建立了可特异检测上述3组Bt基因的三重PCR方法。结果表明,本研究建立的单一PCR和三重PCR方法均可从各类样品中准确检测出预期Bt基因成分,检测灵敏度达到0.1%。本方法特异性强、灵敏度高,在转基因成分的筛选检测中有很好的应用前景。     

Detection of genetically modified rice: collaborative validation study of a construct-specific real-time PCR method for detection of transgenic Bt rice

A collaborative trial study has been conducted for validation of an extraction method and a subsequent real-time PCR for detection of a transgenic Bt rice line (‘Bt63’) in rice products originating from China. A total of 17 laboratories participated in the study and each laboratory received 16 coded samples comprising of rice grain flours, rice noodle flours and plasmid DNAs. Of the accepted results all Bt63-positive rice grain samples (0.1 or 0.05% w/w) and all rice noodle samples prepared from marketed rice products were detected correctly. The result demonstrates that ‘Bt63’ rice is detectable even at low relative mass concentrations of 0.05%. The absolute LOD determined with plasmid DNA samples showed to be at least five copies of the ‘Bt63’ target sequence. The data provided in this study show that the method is fit-for-purpose to inspect Chinese rice products for the presence of EU-unauthorised rice lines carrying the ‘Bt63’ construct.     

Detection of genetically modified rice: a construct-specific real-time PCR method based on DNA sequences from transgenic Bt rice

Genetically modified rice varieties developed in China are close to approval for agricultural cultivation and production. However, so far no method has been reported for specific detection of transgenic varieties of this crop. In the present study, rice seeds assumed to consist of field-tested Bt rice (‘Anti-pest Shanyou 63’ and ‘Anti-pest Jinyou 63’) were used as reference material to determine transgenic DNA sequences. The transition between the cryIA(b) and cryIA(c) fusion gene and the nopaline synthase terminator (nos) sequence was used to develop a construct-specific real-time PCR based detection method. This Bt rice specific detection system was combined with a recently published quantitative real-time PCR method for the rice-specific (Oryza sativa L.) reference gene gos9. The complete PCR assay for detection of transgenic Bt rice was in-house validated and the limit of quantification was found to be below 0.1% Bt rice relative to the rice content. Application of the PCR assay should allow more precise detection of transgenic rice varieties in imported food products which are so far not approved in the EU.     

Toxicological evaluation of transgenic rice flour with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) transgenic (KMD1) and non‐transgenic (KMD1′s parental variety Xiushui 11) rice flours were assessed in a 90 day feeding test with rats. KMD1 contained a synthetic cry1Ab gene from Bt, and selection marker genes nptII and hpt linked in tandem. In the≤64 g kg^?1 body weight (BW) dosage range (Bt transgenic rice flour composed 64% of the ingredients of the diet), no adverse effects of Bt rice on rats were observed in terms of animal behaviour, weight gain and feed utilisation rate. Necropsy at the end of the experiment indicated that neither pathological lesions nor histopathological abnormalities were present in organs such as liver, kidneys, intestines and testes of rats in both test and control groups by macroscopic and microscopic pathology. In addition, no significant differences (P > 0.05) were observed in relative organ weights, haemograms and blood indices of rats between test and control groups. Several serum parameters of female rats were found to be significantly different between Bt and non‐Bt diets, but the values of these parameters were still within the normal ranges of values for rats of this age and sex. These results demonstrated that Bt rice flour at a dosage of 64 g kg^?1 BW, Bt toxin and NPTII and HPT proteins have no toxic effects on rats. © 2002 Society of Chemical Industry     

转基因水稻与亲本糙米中主要化学成分的分析评价

为了考察转基因水稻安全性问题,在相同的种植、采样、样品前处理等前提下,以2009年及2010年收获的转基因水稻（YG-1、YG-2）与亲本糙米为材料,测定及分析样品中的主要营养成分（灰分、蛋白质、氨基酸、脂肪及淀粉）、微量元素和抗营养因子等。结果表明：除转基因水稻和亲本糙米中的Fe、Mn、Cu含量存在差异外,转基因水稻和亲本糙米中主要营养成分、其他微量元素及抗营养因子均无显著性差异。说明在水稻转基因过程中并未显著改变原亲本的主要营养品质,具有实质等同性。     

复合PCR荧光检测方法检测转基因水稻品系

建立一种高通量的转基因复合聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）荧光检测方法,该方法通过对转基因检测内源、外源及品系基因检测引物进行荧光标记,经复合PCR扩增和毛细管电泳荧光检测,实现特异性强、高通量检测。结果表明,复合PCR荧光检测方法检测4 种转基因水稻品系特异性好,并且灵敏度达到0.1%,可以在进出口检验检疫、食品安全监测等领域进行应用。     

我国食品安全突发事件应急管理体系研究及环境污染案例分析

本文首先对我国食品安全应急管理体系研究现状进行综述,并对我国基层食品安全应急管理体系进行调查。再以镉大米事件的应对为例,在问卷调查和实证研究的基础上,对环境污染食品型突发事件的消解式应急处置进行了分析,最后提出完善食品安全应急管理体系的六点建议。     

PCR-based quantification of genetically modified Bt maize: single-competitive versus dual-competitive approach

 Methods for the quantification of transgenic insect-resistant Bt maize by single- and dual-competitive PCR were developed. The analysis of mixtures of DNA solutions, as well as of maize flours containing defined amounts of Bt maize, demonstrated the usefulness of single-competitive PCR based on coamplification of the CDPK promoter/cryIA(b) gene region of Bt maize and an internal standard. Upon heat treatment of DNA solutions and maize flour, respectively, the recovery of the Bt proportion compared to the starting material determined by single-competitive PCR decreased significantly. This systematic error could be compensated for by using a dual-competitive approach based on PCR quantification of the transgenic target sequence of Bt maize and of the maize specific invertase gene (ivr1). Received: 24 January 2000 / Revised version: 25 February 2000