温度对龙眼体胚发生早期POD活性及同工酶的影响

以龙眼品种红核子LC2胚性细胞系诱导获得的体胚发生早期过程中不同发育阶段的同步化胚性培养物为材料,2个温度梯度(20 ℃、30 ℃)处理,以25℃为对照,初步研究了POD活性及同工酶在龙眼体胚发生早期的变化规律.结果表明:不同温度处理的胚性培养物,随着胚性细胞的分化,POD活性总体呈下降趋势,且无论高温(30℃)或低温(20 ℃)处理后龙眼体胚发生早期各阶段胚性培养物的POD活性均明显大于对照(25 ℃);温度处理对龙眼体胚发生早期POD同工酶谱影响也较大,表现为新谱带的出现.推测POD活性与同工酶谱的规律变化与龙眼体胚发生早期细胞分化以及维持体胚正常发育有密切关系.     

龙眼体胚发生过程中的RNA研究初报

龙眼 ( Dimocarpus longan L our.)属无患子科 ( Sapindaceae)龙眼属 ,是起源于我国的一种重要热带、亚热带木本果树 .近 1 0多年来 ,赖钟雄等在前人 [1 ]的研究基础上 ,建立了龙眼体细胞胚胎高频率发生系统 ,这是在木本植物中最为优良的体胚发生系统之一 ,可作为木本植物体胚发生的模式系统 [2 - 6] .植物的体细胞胚胎发生的机理研究是目前植物细胞工程的前沿和优先发展领域 [7- 8] ,对于研究植物细胞全能性的机制、基因的表达和胚胎的发育具有重要意义 ;同时 ,由于体细胞胚胎发生过程与合子胚胎类似 ,即类似的分子机制调控着在体内 ( in…     

龙眼胚性愈伤组织AGO6基因克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

依据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,利用RT-PCR结合RACE技术,以龙眼胚性愈伤组织c DNA为模板,获得Dl AGO6基因的c DNA全长序列,共3 168 bp(登录号为KF819529),完整开放阅读框2 700 bp,编码900个氨基酸。生物信息学分析表明:Dl AGO6的c DNA所编码的氨基酸序列含有2个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与拟南芥AGO6蛋白序列有较高的同源性。龙眼体胚发生过程中Dl AGO6表达量的q PCR分析表明:Dl AGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织时期的表达量最高,在鱼雷形胚时期表达量最低,推测DLAGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织阶段的高表达量,可能与细胞的旺盛分裂有关。     

龙眼体胚成熟过程中淀粉含量的变化

研究了光照条件、蔗糖含量、聚乙二醇(PEG6000)、脱落酸(ABA)及椰乳等因素对龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化的影响.结果表明:在光照低糖(质量分数为2%,下同)、光照高糖(质量分数为5%,下同)、黑暗低糖加PEG6000的作用下,龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化相似,整个成熟过程中呈单峰型;在黑暗低糖、黑暗低糖加ABA、黑暗高糖加ABA、黑暗高糖加椰乳作用下,龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化呈双峰型.在黑暗和高糖作用下且经历正常成熟的体胚中淀粉含量变化也很相似,总趋势都是上升的.     

龙眼体胚Obg1基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

本试验克隆了龙眼体胚Obg1基因(DLObg1)的3个转录本.序列分析表明,DLOBG1蛋白具有典型的OBG蛋白结构域,与其他植物的OBG蛋白具有较高的同源性,与葡萄、蓖麻和玉米的氨基酸序列同源性分别为84%、84%和82%.实时荧光定量PCR分析显示,DLObg1基因的转录水平随龙眼体胚的发育而变化,在心形胚和鱼雷形胚阶段的表达量最高,可能与子叶等器官的形成有关.     

龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中生物大分子的动态变化

测定了龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中若干生物大分子的动态变化.结果表明:龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中淀粉有2个累积峰值,第1次出现在胚性愈伤组织阶段,第2次出现在球形胚阶段,在鱼雷形胚阶段又有一个小回升,这时淀粉积累较心形胚和子叶形胚阶段高一些;随着胚胎的发育,DNA、RNA、总核酸含量的变化趋势大致相同,最高点均出现在心形胚阶段,其中RNA含量的变化较DNA、总核酸含量明显,蛋白质含量的变化曲线呈“S”形.这些生物大分子的动态变化表明,它们对于体胚的发生和发育起着重要作用.     

龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达

以龙眼体胚发生早期的胚性培养物为材料,通过简并引物结合PCR进行cDNA末端快速克隆(RACE)的技术,克隆到了龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5全长序列,其cDNA全长为887 bp,由681个核苷酸组成的开放阅读框,编码226个氨基酸(GenBank登陆号为GQ443759).该基因推导的蛋白分子质量为24511.9 u,理论等电点pI为9.65;该蛋白是Frigi-da-like蛋白质家族成员,是一个具有Frigida组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,并且主要集中在C端区域.实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,呈"N"形趋势,其中以不完全胚性紧实结构阶段最高,而鱼雷形胚阶段表达量最低;方差分析表明,鱼雷形胚阶段DlUP-5基因表达量与其他7个阶段存在极显著差异.该研究结果对DlUP-5基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼胚性愈伤组织胚胎发生能力、早期体胚正常发育和体胚成熟过程等方面可能起重要作用.     

限制生长保存龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程的RAPD分析

以红核子龙眼不同保存时间(5个月、3 a、13 a)的不同发育阶段体胚为材料,对限制生长保存后的胚性愈伤组织(EC)的体胚发生过程进行随机扩增多态性DNA(RAPD)分析;筛选10条随机引物,对EC不同发育阶段体胚的基因组DNA进行扩增.结果表明:龙眼EC不同发育阶段体胚的RAPD谱带存在一定的差异,但不同保存时间的EC在体胚发生过程中的相对变异率都保持在比较小的变异范围内,小于5.1%.     

荔枝胚状体POD与EST同工酶酶谱分析

采用不连续垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳,对荔枝"元红"品种幼胚胚性愈伤组织诱导出的胚状体进行过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶谱分析.结果表明:染色方法对同工酶谱谱带有影响;同一发育阶段的荔枝胚状体的过氧化物酶与酯酶同工酶谱有一定差异,表明不同胚状体之间可能已产生一定的遗传变异.     

龙眼体细胞胚胎发生过程中内源多胺的变化

采用高效液相色谱测定了龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中内源多胺含量的变化.结果表明:龙眼胚性愈伤组织中内源多胺含量比非胚性愈伤组织高;体胚发生过程中内源多胺含量变化趋势大致呈“M”状,在胚性愈伤组织Ⅱ和球形胚阶段转折;内源多胺含量的变化先于形态学的变化.     

龙眼胚性培养物蛋白质水平双向电泳技术体系的建立

以龙眼胚性培养物为材料,使用Pharmacia多功能水平电泳仪(Multiphor ),采用滤纸半干电泳与梯度凝胶技术,建立了适合于龙眼胚性培养物的蛋白质水平双向电泳技术体系.使用该技术有望对龙眼体细胞胚胎发生过程中特异蛋白进行研究.     

龙眼体胚发生中期发育同步化的初步调控

试验以龙眼"红核子"胚性愈伤组织为材料,对龙眼体细胞胚胎发生进行同步化调控,2,4-D浓度为0.07mg/L时获得了心形胚,2,4-D浓度为0.05mg/L和0.06mg/L时获得了鱼雷形胚,2,4-D浓度为0mg/L时获得了高度同步化的子叶形胚。研究表明,通过培养基中2,4-D浓度的微量调整,基本能够控制龙眼体胚发育中期心型、鱼雷形胚的发育同步化。     

龙眼体细胞胚胎发生过程中特异表达蛋白的双向电泳分析

以龙眼品种红核子LC2胚性细胞系为材料,进行体细胞胚胎(简称体胚)发生及其同步化调控,获取体胚发生过程中各个主要发育阶段的培养物(胚性愈伤组织、球形胚、子叶形胚、早期成熟胚、中期成熟胚、晚期成熟胚),采用双向电泳对体胚发生过程中特异表达蛋白进行分析.结果表明:(1)龙眼胚性愈伤组织中,pI为4-5的酸性蛋白表达种类最多,在体胚发育的过程中逐渐消失,相反,pI为5-6的微酸性蛋白的表达逐渐增多;(2)体胚发育后期,尤其是成熟胚晚期,分子质量大的蛋白大量减少,分子质量较小的蛋白增多并逐渐积累;(3)虽然在各个发育阶段都会出现一些新的特异蛋白,但是没有改变蛋白质种类逐渐减少的趋势;(4)发现了一些有差异的特异蛋白点,尤其是成熟胚后期,有一系列大分子质量的蛋白消失,新出现了一部分分子质量较小的蛋白,其中几种表达量很大,可能与体胚发育有密切关系.     

龙眼胚性愈伤组织体胚发生同步化调控及组织细胞学观察

以龙眼“红核子”胚性愈伤组织为材料 ,对龙眼体细胞胚胎发生进行同步化调控 ,并采用石蜡切片进行组织形态学观察 .结果表明 ,通过控制培养基中 2 ,4-D质量浓度可以调控龙眼体胚的发育进程 ;龙眼胚性愈伤组织的胚胎发生一般是内起源 ,且起源于单细胞     

龙眼胚性愈伤组织LEC1基因cDNA克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织Leafy Cotyledon 1(LEC1)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(简称体胚)发生过程中的表达情况.采用RT-PCR结合RACE法及TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织LEC1基因的cDNA全长序列,运用生物信息学方法对该序列...     

龙眼体胚发生过程中tRNA怀丁苷合成蛋白基因(Dltyw1)的克隆及表达分析

根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库信息,进行龙眼胚性愈伤组织tRNA怀丁苷合成蛋白基因(Dltyw1)cDNA全长克隆及其在体胚发生过程中的定量表达分析.结果表明:Dltyw1基因全长2273 bp,包含1920 bp ORF,编码640个氨基酸,将此基因登录GenBank,登录号为JF733783;Dltyw1含有flavodoxin 1、Radical SAM及Wyosine form功能域,进化树分析显示,Dltyw1与其他物种twy1基因具有较高同源性.荧光定量PCR技术分析表明,Dltyw1基因在龙眼体细胞心形胚时期呈现表达高峰,并在子叶形胚阶段迅速下降至最低点,由于心形胚是体细胞胚胎发生由球形胚向各组织器官发育的关键阶段,表明twy1基因在体胚发生过程中的组织器官发育及形态建成阶段的转录后调控方面起重要作用.