猪角朊细胞复合小肠黏膜下层体外培养实验

目的 探讨脱细胞小肠黏膜下层（SIS）作为组织工程皮肤支架的可行性.方法 将猪第二代角朊细胞接种于SIS上,接种后第11、13、15、17天通过直接染色、石蜡组织切片、HE染色、抗层粘连蛋白免疫组化染色、透射电镜等方法,观察角朊细胞在SIS上的生长情况.结果 猪角朊细胞接种在SIS上11d形态良好,部分区域形成2～3层细胞组成的复层结构,免疫组织化学染色显示在角朊细胞与SIS之间的细胞外基质中抗层粘连蛋白呈连续阳性表达.13、15、17 d细胞复层结构增多,细胞之间连接紧密,透射电镜下可见细胞内有张力微丝,细胞间有桥粒连接,角朊细胞与SIS之间可见基底膜形成.结论 在猪角朊细胞体外培养中,SIS是良好的细胞黏附支架.     

角朊细胞与创面愈合

烧伤是以皮肤及软组织损伤为主要特点的外伤 ,创面愈合的速度及质量是评价治疗水平高低的惟一可靠指标。在创面愈合过程中起主导作用的细胞是表皮细胞 ,它包括角朊细胞、黑色素细胞、朗格罕细胞及未分型树突状细胞 ,其中角朊细胞在数量上占绝大多数[1] 。因此 ,烧伤创面愈合的关键在很大程度上取决于角朊细胞的功能[2 ] 。一、角朊细胞培养1.历史 :2 0世纪 5 0年代 ,随着组织培养技术的迅速发展 ,角朊细胞的培养也进入了新阶段 ,Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｎ和Ｒｅｙｕｏｌｄ用胰酶分离角朊细胞获得成功 ,Ｃｒａｉｃｋｓｈａｎｋ实现了在体外培养角…     

培养的自体角朊细胞膜片与异体真皮重组复合皮移植的实验研究

目的探讨用自体培养的角朊细胞膜片（ＣＫＳ）及异体真皮重组复合皮移植后的成活机理和组织学变化。方法以３０只ＳＤ大鼠为实验动物,分为自体ＣＫＳ组及异体复合皮组。术后９０天内定期检查并取活检标本作组织学检测,观察移植物存活情况,伤口愈合,表皮真皮连接区的重建和异体真皮的归宿等。结果自体角朊细胞膜片成活尚好,但其质地及组织学结构欠佳,且太薄易磨损和破溃;胶原纤维增生并排列错乱,创面明显收缩。异体复合皮组不仅移植物成活好,且质地、组织结构、创面收缩及抗磨损等方面均优于ＣＫＳ组,移植后９０天仍能看到异体真皮成分,未见明显的免疫排斥反应。结论体外培养的自体角朊细胞膜片不适用于全层皮肤缺损的创面,而异体真皮复合皮有潜在的发展前景。     

培养的自体角朊细胞膜片与异体真皮重组复合皮移植的实验研究

目的探讨用自体培养的角朊细胞膜片(CKS)及异体真皮重组复合皮移植后的成活机理和组织学变化。方法以30只 SD 大鼠为实验动物,分为自体 CKS 组硬异体复合皮组。术后90天内定期检查并取活检标本作组织学检测,观察移植物存活情况,伤口愈合,表皮-真皮连接区的重建和异体真皮的归宿等。结果自体角朊细胞膜片成活尚好,但其质地及组织学结构欠佳,且太薄易磨损和破溃;胶原纤维增生并排列错乱,创面明显收缩。异体复合皮组不仅移植物成活好,且质地、组织结构、创面收缩及抗磨损等方面均优于 CKS 组,移植后90天仍能看到异体真皮成分,未见明显的免疫排斥反应。结论体外培养的自体角朊细胞膜片不适用于全层皮肤缺损的创面,而异体真皮复合皮有潜在的发展前景。     

脱细胞羊膜与脱细胞小肠黏膜下层修复猪创伤性皮肤缺损的比较研究

目的 比较脱细胞羊膜与脱细胞小肠黏膜下层作为创伤性皮肤缺损覆盖物,对创面修复的效果。方法 7只四川长白小猪,每只猪背部两侧各做3个4 cm×4 cm大小的皮肤缺损,深达深筋膜。每侧缺损随机分为3组,用不同敷料覆盖。A组：双层脱细胞羊膜；B组：双层脱细胞小肠黏膜下层；C组：空白,生理盐水纱布覆盖。术后观察创面局部情况、创面愈合率,10 d(2只,各组4个皮肤缺损)、20 d(2只,各组4个皮肤缺损)、30 d(3只,各组6个皮肤缺损)处死动物取材。行组织学观查,炎性细胞、血管内皮细胞及增殖细胞计数,羟脯氨酸含量测定。 结果A、B组覆盖的敷料与创面黏附紧密,与纱布无粘连,更换敷料时创面无渗血。C组纱布与创面黏附紧密,术后22 d前更换纱布时创面出血。组织学观察：术后各时间点A、B组皮下组织内炎性细胞数较C组少；C组皮下组织内胶原分布较A、B组紊乱。术后各时间点A、B组创面愈合较C组高,差异有统计学意义(P<0．05)；C组术后各时间点炎性细胞计数、皮下组织及肉芽组织内增殖细胞数明显高于A、B组,术后20、30 d,羟脯氨酸含量高于A、B组,差异有统计学意义(P<0．05)；3组内皮细胞计数,差异无统计学意义(P>0．05)。A、B组创面局部情况、创面愈合率、病理组织学检查、炎性细胞数计数、血管内皮细胞计数、增殖细胞计数和羟脯氨酸含量,差异均无统计学意义(P>0．05)。 结论 采用脱细胞羊膜、脱细胞小肠黏膜覆盖创伤性皮肤缺损,有提高创面愈合率、减少炎性反应,控制皮下组织及肉芽组织中细胞增殖,使胶原纤维有序排列的作用,能减少创面组织的出血和渗出。脱细胞小肠黏膜覆盖创面具有与脱细胞羊膜覆盖创面相近的修复效果。     

人角朊干细胞体外筛选及鉴定的实验研究

目的探讨体外筛选及鉴定人角朊干细胞(KSC)的方法. 方法利用KSC对细胞外基质的快速黏附性,选择不同时间黏附的细胞分为5、20和60分钟3组,并以不进行筛选的细胞作对照组.体外培养扩增后,以KSC的相对特异性标识分子β1整合素、角蛋白19(Ck19)的单克隆抗体,免疫组织化学方法对各组细胞进行鉴定,利用图像分析系统测平均灰度值.并用流式细胞仪、透射电镜对各组细胞进行检测. 结果各组细胞在10～14天均有克隆形成,组间比较5分钟组细胞生长较慢,但形成克隆较大,细胞体积较小.免疫组织化学β1整合素、Ck19在各组都有表达,各组平均灰度值统计学分析显示,β1整合素在5分钟组的表达与另3组间有统计学意义(P<0.05),Ck19的表达在5分钟组与20分钟组间无差异(P>0.05),60分钟组与对照组间差异不显著,而前两组与后两组之间比较有统计学意义(P<0.05).流式细胞仪检测提示5分钟组细胞大部分处于G1期,与其它3组有区别.透射电镜显示5分钟组细胞体小,核浆比大,细胞器不成熟. 结论利用细胞外基质筛选的5分钟组细胞处于幼稚状态,并有强克隆形成能力,符合预期的KSC特点,可利用KSC对细胞外基质的快速黏附性对其纯化筛选,同时利用β1整合素、Ck19的单抗加以鉴定.     

人羊膜细胞外基质与成纤维细胞体外培养的实验研究

目的通过人羊膜细胞外基质(HA-ECM)与成纤维细胞体外培养,观察成纤维细胞在HA-ECM上的生长特性,以及胶原原纤维产生情况,为使HA-ECM成为皮肤组织工程化的载体打下基础.方法将不同浓度的成纤维细胞种植于HA-ECM上进行体外培养,通过倒置显微镜、光镜及透射电镜,观察细胞在HA-ECM的生长、排列,以及细胞的粘附和胶原原纤维产生情况.结果梭形的成纤维细胞在HA-ECM上生长良好,呈放射状或平行排列;组织切片发现HA-ECM上有较多梭形细胞附着,细胞排列紧密;电镜下见成纤维细胞胞膜基底部向HA-ECM内伸出数个突起,细胞与羊膜基质粘附相当牢固,胞外有较多胶原原纤维堆积. 结论种植于HA-ECM的成纤维细胞有一个最适宜的细胞浓度(3.5×106 个/ml);HA-ECM具有良好的支架和渗透作用,成纤维细胞在其上生长、粘附良好,胶原合成、分泌旺盛,HA-ECM是一种较理想的成纤维细胞载体.     

皮肤角朊细胞的三维培养

<正>表皮角朊细胞(keratinocyte,KC)是皮肤创伤后再上皮化过程中的主要功能细胞,其增殖和移行是创缘皮肤早期修复的重要生物学过程[1,2]。在体内外环境下探索和检测各种分子类药物、纳米颗粒材料等对KC增殖、移行和分化的功效以及创伤后组织结构和功能的快速修复,是微创治疗的热点研究内容之一[3]。KC的培养作为开展相关研究工作的前提,因其在体外环境贴壁性差,细胞活力低,增     

Ⅱ度烧伤病人皮肤角朊细胞ICAM—1的表达

目的 探讨Ⅱ度烧伤伤面愈合过程中角朊细胞间附分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达及其意义。方法 应用免疫组织化学染色技术,对烧伤后不同时间Ⅱ度烧伤皮肤组织角朊细胞ＩＣＡＭ－１的表达进行动态观察。８例健康人皮肤,６例烧伤病人正常皮肤及８例Ⅱ度烧伤愈合后增生性瘢痕组织为对照组。结果 健康人正常皮肤基底层细胞ＩＣＡＭ－１可低表达,烧伤病人正常皮肤基底层细胞ＩＣＡＭ－１可表达增强。Ⅱ度他面基底层细胞伤后１周内Ｉ     

无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植的研究

目的　研究用无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植的效果及组织学变化。方法　将 4 2只裸鼠分为实验组及对照组 ,实验组于背部全层皮肤缺损创面移植无细胞异种真皮及人表皮细胞悬液 ,对照组单纯移植人表皮细胞悬液。于术后 2、3和 5周计算创面愈合率 ,术后 3、6和 12周计算创面收缩率 ,并取活检行组织学检测。结果　实验组创面愈合率高 ,分别为 79.1%± 4 .5 % ,89.6 %± 4 .4 % ,98.1%± 3.4 % ,收缩程度轻为 16 .3%± 5 .2 % ,2 5 .5 %±7.2 % ,32 .5 %± 7.1% ,外观平整 ,质地良好 ,胶原纤维排列整齐 ,基底细胞桥粒 -半桥粒结构及基底膜等结构重建明显 ,未见明显的急性排斥反应 ;对照组创面愈合率分别为 6 9.2 %± 4 .9% ,78.2 %± 7.6 % ,90 .6 %± 5 .0 % ,收缩率为2 0 .5 %± 6 .0 % ,31.3%± 6 .9% ,4 4 .6 %± 7.2 % ,与实验组相比 ,均有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,愈合后的表皮质地薄 ,易破溃 ,胶原纤维紊乱 ,表皮 -真皮连接结构重建不明显。结论　无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植修复创面 ,可改善创面愈合质量。     

生物衍生羊膜对大鼠跟腱粘连影响的实验研究

目的研究生物衍生羊膜预防SD大鼠跟腱粘连的效果,并为临床预防术后跟腱粘连提供实验数据.方法以28只SD大鼠后肢跟腱为实验模型,切断并缝合跟腱,实验侧跟腱包裹生物衍生羊膜,对侧不包裹作为对照,术后1、2、4、6、8和12周分别取跟腱,大体及组织学观察跟腱的粘连、愈合情况. 结果术后各时间点两侧跟腱吻合处炎性细胞浸润情况、跟腱愈合进程无明显差别,跟腱粘连的半定量评分表明实验侧和对照侧差异有统计学意义(P<0.05) 结论生物衍生羊膜能有效预防跟腱粘连,是一种较为理想的预防跟腱粘连的生物材料.     

膀胱平滑肌细胞与小肠黏膜下层体外复合培养的实验研究

目的探讨体外快速培养犬膀胱平滑肌细胞的方法及观察膀胱平滑肌细胞在脱细胞小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS上的生长状况,为构建组织工程膀胱平滑肌组织提供实验依据。方法分别采用酶消化法和组织块培养法分离、获取和原代培养犬膀胱平滑肌细胞,倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况,透射电镜观察细胞的超微结构,免疫组织化学染色进行细胞鉴定。将犬膀胱平滑肌细胞接种到SIS支架材料上,于复合培养5、7及9d取材,行苏木素染色、石蜡切片HE染色和扫描电镜观察膀胱平滑肌细胞在SIS上的生长状况。以细胞-SIS复合培养组为实验组,以膀胱平滑肌细胞为对照组,每组各设9孔,分别于接种后3、5及7d取材,酶消化后收集细胞并计数。结果酶消化法原代培养获取犬膀胱平滑肌细胞数量多,细胞生长速度快,形态良好,培养5d细胞在培养瓶底生长汇合。组织块培养法接种3d见长梭形的膀胱平滑肌细胞从植块边缘萌出,获取的细胞数量较少。透射电镜下见膀胱平滑肌细胞胞质中有特征性细肌丝和细胞膜的密斑。抗α-肌动蛋白免疫组织化学染色胞浆呈棕黄色阳性反应。膀胱平滑肌细胞在SIS表面能黏附、生长和增殖。体外复合培养5d后,膀胱平滑肌细胞铺满SIS表面,呈单层细胞结构。7、9d细胞形态与5d相似。实验组3、5及7d的细胞计数分别为(16.85±0.79)×105、(39.74±2.16)×105及(37.15±2.02)×105个,对照组分别为(19.43±0.54)×105、(34.50±1.85)×105及(33.07±1.31)×105个。两组5d细胞计数差异有统计学意义(P<0.05)。结论酶消化法原代培养膀胱平滑肌细胞可提供大量活性良好的种子细胞。SIS支持膀胱平滑肌细胞黏附和生长,可为构建组织工程膀胱平滑肌组织提供良好支架。     

猪无细胞真皮基质对人皮肤成纤维细胞黏附及生长的影响

目的　比较成纤维细胞 (FB)在猪无细胞真皮基质 (ADM)上的黏附及生长特性 ,探讨 ADM作为组织工程化皮肤支架材料的可行性。　方法　 FB2 ml细胞浓度为 2 .5× 10 5/ ml,分别接种于经戊二醛交联、未经戊二醛交联、戊二醛交联不含基底膜和戊二醛交联并打孔形成网状的猪 ADM中孵育 ,相同数量 FB接种于空白培养皿中作为对照 ,接种后 1、3及 5天行细胞计数 ,黏附有 FB的 ADM行 HE染色观察。　结果　 FB在经戊二醛交联、未经打孔完整的ADM上的黏附增殖优于未经戊二醛交联或戊二醛交联并打孔的 ADM,是否含完整基底膜对成纤维细胞黏附增殖无明显影响。　结论　采用经戊二醛交联、完整的 ADM有利于 FB的体外培养 ,ADM经一定的修饰后可能作为组织工程化皮肤的支架材料。     

犬膀胱移行上皮细胞的体外连续培养及生物学特征观察

目的探讨犬膀胱移行上皮细胞体外连续培养和纯化方法,为进一步构建组织工程尿路上皮组织提供实验依据。方法无菌获取幼犬膀胱组织,0.125%胰蛋白酶消化获取单细胞悬液,于上皮细胞无血清培养基中培养。采用0.05%胰蛋白酶和0.02?TA消化、纯化细胞,动态观察细胞形态变化和增殖情况,MTT法绘制生长曲线;透射电镜观察细胞超微结构;SABC法对培养的细胞进行免疫组织化学鉴定;并采用流式细胞仪检测不同代次细胞的细胞周期和倍体水平。结果采用酶消化法能从4～6cm2的膀胱黏膜组织中分离获取(1～5)×106个细胞。原代培养接种24h后可见大量细胞贴壁,第7天细胞生长融合达80%～90%,细胞排列呈典型的铺路石样。MTT法测定第3代细胞在传代培养7d生长达高峰;传代并纯化的细胞纯度高,无成纤维细胞污染,至第4～6代细胞仍保持良好形态。透射电镜下,可见上皮细胞特征性张力微丝和细胞间桥粒连接。细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学染色,胞浆呈棕黄色阳性反应。不同代次细胞均为二倍体细胞。结论酶消化法能从较少的膀胱组织中分离获取足量、较纯的膀胱移行上皮细胞,细胞在无血清培养基中能连续传代扩增,可以满足进一步构建组织工程尿路上皮组织的需要。     

小鼠骨髓基质干细胞与脱细胞基质骨联合培养的实验研究

目的　研究小鼠股骨骨髓基质干细胞 (marrow stromal stem cells,MSCs)在同种异体脱细胞基质骨(acellular extra cellular matrix,AECM)上的生长情况。　方法　昆明种小鼠 8只共 16侧股骨 ,用 Triton X- 10 0处理后获 AECM。另将 1月龄昆明种小鼠 2 0只双侧股骨切断 ,用 4 ml PBS反复冲洗骨髓腔后 ,离心分瓶 ,取 MSCs进行原代培养 ,以 5× 10 6 /ml浓度将原代培养的小鼠 MSCs种植于 AECM中 ,进行体外联合培养 7d,通过相差显微镜、光镜、电镜等方法观察细胞在材料中的生长情况。　结果　在 AECM的孔隙中 ,有成团蓝染的 MSCs核团 ,周边部分大于中间部分 ,且靠近细胞培养液层面的 AECM中蓝染的核团数量明显比远离细胞培养液的层面多。 AECM具有良好的孔隙率 ,MSCs可在 AECM上良好生长。　结论　 AECM可作为构建组织工程骨的一种较好的支架材料。     

雪旺细胞在大鼠脱细胞异体神经基膜管中迁移的研究

目的研究大鼠自体雪旺细胞在脱细胞异体神经基膜管中的迁移情况。方法取SD大鼠坐骨神经20mm,用化学萃取法制备脱细胞神经,行大体观察、HE、抗层黏蛋白（Anti-laminin）染色。另取32只雌性SD大鼠,体重250～300g,切取自体坐骨神经2mm,置于分别长10mm的两段大鼠异体脱细胞坐骨神经基膜管之间,形成22mm长的基膜管-自体神经嵌合体,与同样长度的单纯脱细胞神经基膜管埋入肌间隙中,于5、10、15和20d取材,行HE、S-100免疫组织化学染色。结果制备的脱细胞神经基膜管外观呈半透明;HE染色示基膜管内未见细胞核存在,基膜管部分不连续;Anti-laminin染色示基膜管深褐色。基膜管-自体神经嵌合体于术后各时间点HE染色均可见细胞存在,第15天开始可见S-100阳性雪旺细胞;单纯神经基膜管在各时间点HE染色中均可见细胞存在,未见S-100阳性雪旺细胞。结论大鼠坐骨神经的自体雪旺细胞可迁移至两侧异体脱细胞神经基膜管远端,为嵌合自体神经的异体脱细胞神经基膜管修复长段周围神经缺损提供了理论依据。     

组织工程血管模型体外构建的实验研究

目的：在体外环境下，探索构建分别含内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞的三层结构的组织工程化血管，三种细胞相互作用，相互支持，形成一个在形态和功能与正常血管近似的组织工程化血管。方法：通过用胶原分别包埋处理的三个管径大小不同，但能相互嵌套的聚羟基乙酸（PGA）管形支架，并种植人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞进行三维立体生长培养，观察细胞生长分化情况。采用酶消化法和组织块法分离培养人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞并传代，纯化，将聚羟基乙酸（PGA）无纺网用胶原溶液包埋，真空冷冻干燥，形成多孔状PGA＋胶原管型支架；接种3代－7代人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞及人成纤维细胞与其内腔面，采用动脉旋转培养技术体外培养3周，行扫描电镜观察。结果：构建后的血管模型，层与层结构紧密，内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞分泌细胞外基质，相互进行物质交换，类似于生理条件。结论：该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状。此方法的进一步应用组织工程方法构筑具有分层结构的人造血管打下基础。     

几丁质-胶原蛋白膜的制作及皮下埋植实验

目的 探讨几丁质—胶原蛋白膜作为真皮支架的可行性。方法 以酸溶法制备胶原溶液，添加一定比例的脱乙酰化几丁质，冻干成膜，0．05％戊二醛溶液浸泡交联，行体外酶降解实验，检测其耐受酶降解能力；将制备的几丁质—胶原蛋白膜包埋于36只SD大鼠皮下，术后3、5天，1、2、3、4、6、8和12周取材，捡a其组织相容性、血管化能力及材料在体内障解情况。结果 制备的几丁质—胶原蛋白膜，呈微黄、半透明状，纤维排列呈网状，一例较光滑，孔小，另一例孔稍大，孔径大小保持在50～250μm之间，其体外降解缓慢。皮下埋植实验术后5天～2周显示材料具有良好的组织相容性，无明显炎性反应，血管化早，体内障解缓慢；8周后经改建可形成纤维排列较规则的类真皮样结构。结论 几丁质—胶原蛋白膜具有较好的物理及生物学性能，组织相容性好，血管化能力强，体内、外降解缓慢，具有良好的真皮替代功能。