链霉菌抗生素生物合成的基因调控

链霉菌中抗生素生物合成受到许多调控基因的调控,它们通过途径特异性调控方式、全局性调控以及双组分调控方式对基因表达进行调控.概述这些调控基因将有利于改良抗生素生产菌株及新型抗生素的研究,并为改造链霉菌抗生素生物合成相关基因、提高产量提供理论依据.本文归纳了国内外链霉菌抗生素生物合成基因簇各调控基因及其研究进展.     

太乐菌素生产的遗传与生化

太乐菌素是一种由弗氏链霉菌产生的16员的大环内酯抗生素.由一个分支内酯(太乐糖苷)和三个糖(mycaminose,mycarose及mycinose)组成的.作者感兴趣的是(1)遗传修饰弗氏链霉菌改良太乐菌素生产;(2)测定遗传定位以及太乐菌素结构基因潜在群集型;(3)测定太乐菌素生物合成途径以及鉴别限制步骤的速率;(4)应用各种遗传技术建造重组体菌株生产杂种大环内酯抗生素.本文讨论太乐菌素生物合成障碍突变体研究推导的关于太乐菌素生物合成途径目前情况.同时扼要地讨论太乐菌素结构基因图     

灰色链霉菌的链霉素基因簇和卡那霉素抗性序列在某种菌株和菌种间的差别

现在已知抗生素的产生不是菌种异同而是菌株差异而不同。尽管对抗生素生物合成和调节作了大量研究,但对涉及产生抗生素菌株的有关生物化学和遗传学基础研究甚少。研究表明产生氨基糖苷类抗生素(AG)菌株具有与其相关的AG抗性类型,已证明许多抗生素产生菌的生物合成基因和其抗生素抗性基因遗传结构连锁。灰色链霉菌包括产生多种类型抗生素的菌株,如链霉素(SM),金霉素,和灰霉素产生菌。在灰色链霉菌中,各菌株具有较高的DNA同源性,但各菌株产生抗生素的遗传     

卡里霉素产生菌的卡那霉素抗性基因表达

天蓝色链霉菌放线紫红素生物合成基因成功的分子克隆以及它们异种宿主的表达促进了成功克隆其它抗生素生物合成的基因。一种抗生素生物合成所需基因多半同相同抗生素的抗性编码基因和在抗生素合成调控中的基因密切联系。红霉素生物合成基因的克隆就是以这种抗性基因作为工具而取得进展的。我们感兴趣的是簇集生物合成基因表达的控制机制,以及作为生物合成基因是如何调控这些抗性基因的表达的。解决这些问题会有助于链霉菌次级代谢调控和差别的了解。本文阐述被克隆的卡那霉素抗性基因(Kmr)的特征及其在卡那霉素产生菌内的转录调控作用。卡那霉素抗性机制曾报道,变铅青链霉菌1326隐含克隆卡那霉素链霉菌Kmr基因的pMCP5质粒,该     

铵离子抑制a—vermectin生物合成的机理

实验中发现铵离子（NH4^ )对avermectin 的生物合成具有强烈的抑制作用,并对其机理进行了研究,。结果表明：铵离子对avermectin生物合成的抑制作用是通过同时作用于avermectin产生菌（Streptomyces avermitilis)糖代谢过程中的多个位点而实验的,发酵培养基中含有的少量铵离子,造成了avermectin链霉菌胞外淀粉酶的总活力降低;发酵液中的丙酮酸积累量明显降低。菌丝体内葡萄糖－6－磷酸脱氢酶活力降低;琥珀酸脱氢酶活力显著提高,最终造成了糖代谢过程中产生的可用于avermectin生物合成的短链脂肪酸数量减少,进而抑制抗生素的生物合成。     

利福平诱导rpoB基因突变活化变青链霉菌66合成放线紫红素

变青链霉菌拥有完整的放线紫红素生物合成基因簇 ,但它通常并不合成这一抗生素。引入特定的rpoB基因 ,不仅产生了对利福平的抗性 ,同时活化了放线紫红素的合成 ,表明由该基因编码的RNA聚合酶 β亚基因在抗生素的生物合成调控中起十分重要的作用。DNA顺序分析揭示出在rpoB基因上的四种不同突变类型 ,均不同程度地活化变青链霉菌合成放线紫红素 ,表明利福平具有与链霉素类似的功能 ,即活化或加强链霉菌合成抗生素或酶的水平。     

链霉菌的抗生素耐药基因

链霉菌的抗生素耐药基因在抗生素生物合成调控过程中起着重要的作用。同时又是细菌产生耐药性的最根本原因之一，在抗生素的链霉菌中，耐药基因一般与抗生素合成基因紧密连锁，可能是合成基因簇的一部分，在抗生素合成过程中起调节作用。耐药基因可以通过垂直进化（自身突变和选择）和水平进化（基因交换：转化，转导，接合转移）而获得，通过与染色体DNA重组而整合入受体染色体DNA中，或定殖于质粒中，耐药基因一般早于抗生素合成基因表达，诱导耐药性的表达受相应抗生素的诱导，对耐药基因的研究有助于阐明抗生素合成调控途径，筛选抗生素高产菌株，设计更有效的药物。     

弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因编辑及其对泰乐菌素发酵产物的影响

目的 对弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)泰乐菌素还原酶(tylosin reductase,SFR)进行改造以抑制其对泰乐菌素(tylosin)的还原作用，提高泰乐菌素发酵产量和产品质量。方法 在前期对泰乐菌素还原酶编码基因第642位碱基进行定点突变形成终止密码子的基础上，对该基因642位后碱基进行敲除；对基因敲除菌株的生长以及发酵产物中泰乐菌素(A组分)和雷诺菌素(relomycin,D组分)含量进行分析。结果 获得了泰乐菌素还原酶基因部分序列敲除的弗氏链霉菌菌株M1-d1；该菌株培养过程中生长状态及稳定期生物量与原始菌株基本一致，菌落形态正常；泰乐菌素发酵产物中敲除菌株A组分相对含量较原始菌株相比增加了10.08%，而D组分相对含量较原始菌株减少68.75%。结论 弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因部分序列敲除不影响菌体正常生长，但能够抑制泰乐菌素还原酶对A组分的还原作用，提高泰乐菌素发酵产物中A组分含量，显著降低D组分含量。     

宁夏枸杞根际土壤链霉菌V-1-3次级代谢产物分析

摘要：目的 获得链霉菌V-1-3的基因组序列信息,分析其次级代谢产物生物合成基因簇并预测其代谢产物,为发现潜在新抗生素奠定基础。方法 基于16S rRNA基因序列进行菌株属水平鉴定,利用Illumina HiSeq+PacBio测序技术对菌株V-1-3进行基因组测序,采用antiSMASH(v6.0.1)在线工具分析次级代谢产物生物合成基因簇,液-质联用技术检测产生的次级代谢产物。结果 链霉菌V-1-3基因组序列全长8 243 417 bp,平均(G+C)含量为72.14 %,共编码7578个基因,预测到33个生物合成基因簇,利用液-质联用检测到4个代谢物：oxalomycin B、geosmin、coelichelin和ishigamide。结论 来自盐碱地的链霉菌V-1-3具有丰富的次级代谢产物生物合成基因簇,能产生多种次级代谢产物,具有进一步发掘新抗生素的价值。     

构建有序排列的除虫链霉菌基因组的柯斯文库用于工业生产菌株的遗传改造

以容纳DNA大片段的柯斯质粒Supercos-1为载体.构建了除虫链霉菌的基因组文库.对约1000个柯斯质粒上插入片段的两端进行测序,并利用全基因组序列的信息,构建了覆盖约91%基因组的有序排列的柯斯文库.利用入λ-Red高效DNA重组和大肠埃希菌-链霉菌接合转移技术,建立了除虫链霉菌的基因组遗传操作系统.运用该系统可以在除虫链霉菌工业菌株中进行高效、精确的基因敲除工作和连续的基因缺失研究,获得可以用来生产多拉菌素的工程菌株.     

阿维菌素产生菌的生物技术改造研究进展

目的综述近年来运用基因工程技术对阿维菌素产生菌改良的研究进展。方法在查阅国内外文献近100篇的基础上,介绍了阿维菌素的生物合成途径,产生多组分的3个关键酶及阿维菌素产生菌改良的研究进展,包括选择性生产有效组分,产生新抗生素、杂合抗生素,改进生产工艺以及提高菌种产抗生素量。结果目前国内外均已经构建了只产生B组分及寡霉素基因缺失或失活的工程菌。分别运用突变结合理性化筛选和特定基因重组提高活性高的组分的产量,并且通过基因改造产生多种阿维菌素的衍生物;将透明颤菌的血红蛋白基因引入阿维菌素产生菌,改进氧的供应,阿维菌素的产量不断提高。阿维菌素生物合成调控机制和组合生物学改造聚酮合成酶等方面仍需深入研究。结论利用生物技术改造阿维菌素产生菌在组分改造、结构修饰、产品收率、生产工艺改进等方面已取得显著进展。对阿维菌素和其他聚酮体药物产生菌的生物合成、基因改造起着重要作用,使生产简化,成本降低,药物应用更广泛。     

只产阿维菌素B组分的基因工程菌的构建

目的通过对阿维菌素生物合成基因C5-O-甲基转移酶基因(aveD)内部进行缺失,使aveD基因失活,从而获得只产生阿维菌素B组分的基因工程菌。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pZHJ06,通过接合转移将缺失部分片段的aveD基因以双交换的方式整合到阿维链霉菌的染色体上。采用摇瓶进行发酵,采用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液中阿维菌素的组分。结果重组菌株不再产生阿维菌素A组分,只产生阿维菌素B组分,并且B组分的总产量也有所提高。结论将阿维链霉菌的aveD基因失活,并不影响下游酮基还原酶基因(aveF)基因的表达,重组菌株只产生阿维菌素B组分。     

阿维菌素研究进展与产业综述

阿维菌素是阿维链霉菌发酵产生的十六元大环内酯类抗生素,主结构与米尔贝霉素相似,用于农业害虫防治和动物的杀虫杀螨,还具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、消炎和醒酒等功效。它通过抑制RNA复制酶,阻止病毒蛋白进入细胞核以及封闭剌突蛋白等方式,阻止病毒的复制感染和传播。已经产生抗药性的分枝杆菌和金黄色葡球菌也能被阿维菌素抑制。阿维菌素世界上年需求量为5000吨左右,基本由中国企业生产。本文回顾了阿维菌素在菌种技术、发酵技术、提取技术、制剂技术发展和组合生物学手段在本产业中的应用,建议通过菌种筛选技术、胞壁通透性调整、途径工程指导的基因改造、发酵过程的代谢流控制、气升式发酵罐应用及细胞融合育种来提高发酵水平,将阿维链霉菌与米贝霉素链霉菌细胞融合育种。     

aveD基因失活提高阿维菌素工业菌株B组分产量

目的 破坏除虫链霉菌aveD基因,提高阿维菌素B1a的发酵单位.方法 将aveD基因内部364bp的SmaⅠ-SmaⅠ片段以相反的方向插入到原位置,构建重组质粒pUAmT-D7,并转化到阿维菌素工业生产菌Streptinomyces avermitilis G-8,筛选得到ave基因失活的基因工程菌G8-17.结果 发酵结果表明,G8-17不产维菌素A组分,而B组分的发酵单位则有相应的提高,其中有效组分B1a的发酵单位提高了33.6％.结论 aveD基因内部片段倒位没有影响下游与之共转录的基因aveF的表达,同时能有效阻断阿维菌素A组分的产生,提高B组分的发酵单位.     

阿维菌素产生菌的诱变育种

目的提高产生菌B1a组分的产量。方法采用诱变剂亚硝基胍处理菌种 ,以含 1g·L-1甲硫氨酸的分离培养基作为定向筛选的分离平板 ,挑选生长快的菌落进行初筛、复筛。结果筛选得到高产菌株中B组分含量显著提高 ,其中得到的突变株M— 2 0经摇瓶初、复筛和传代实验表明是稳定的B组分高产变异株 ,其B组分含量达 82 1% ,较出发菌株提高 14 6 % ,其中B1组分达5 2 4 % ,较出发菌株提高 19 3%。结论采用NTG诱变结合使用含 1g·L-1甲硫氨酸的平板进行筛选可以获得阿维菌素B组分显著提高的菌株     

泰乐菌素基因工程菌的构建

目的构建具有双拷贝tylF基因的泰乐菌素基因工程菌,以解决泰乐菌素基因生物合成的限速环节,提高泰乐菌素的发酵产量。方法通过SOE-PCR获得PermE-tylF基因,构建随机整合型重组质粒pBH05,通过接合转移将PermE-tylF基因及其载体随机整合到弗氏链霉菌的基因组中,并通过抗性筛选获得重组菌株D-120。将重组菌株D-120进行摇瓶发酵,采用生物效价测定的二剂量法测定泰乐菌素的发酵单位。结果在相同的发酵条件下,重组菌株泰乐菌素的发酵单位较出发菌株提高32.7%。结论该基因工程菌的构建改善了泰乐菌素生物合成的限速环节,大幅度提高了泰乐菌素的发酵效价。     

双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株

目的选育高产阿维菌素产生菌。方法分别以紫外线和加热灭活阿维菌素产生菌Strepto-myces avermitilis620和Streptomyces avermitilis632原生质体,并将2种灭活的原生质体用PEG4000融合,从融合株中筛选阿维菌素高产菌种。结果获得高产阿维菌素融合株StreptomycesavermitilisF32,总发酵单位达3 904 mg.L-1,其中B1a组分产量较高,达1 016 mg.L-1,分别较出发菌株S.avermitilis 620、S.avermitilis 632提高117.1%和103.6%。结论双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株是值得推广的一种选育方法。     

The distribution of DNA sequences hybridizing with antibiotic production and resistance gene probes within type strains and wild isolates of Streptomyces species.

Total DNA preparations from 74 antibiotic-producing type strains and 102 natural Streptomyces isolates were examined by dot blots for homology to 6 antibiotic production and resistance genes. Pattern diversity of hybridizations decreased as stringency increased from 65% to 85%. There were 146 unique profiles at 65% stringency with 13 repeated patterns, whilst there were only 14 unique and 11 repeated profiles at 85% stringency. Most of the strains which hybridized at 85% reacted with one or two probes although a few strains showed multiple homologies. This data was used to cluster strains and the groups defined were examined for phenotypic antibiotic resistance. Producers of certain classes of antibiotics clustered to specific groups and some gene homologies were more common amongst strains which produced similar antibiotics.     

New antibiotic-producing streptomycetes, selected by antibiotic resistance as a marker. II. Features of a new antibiotic-producing clone obtained after fusion treatment

A new antibiotic-producing Streptomyces strain SK2-52 obtained by a protoplast fusion treatment between Streptomyces griseus NP1-1 and S. tenjimariensis NM16 showed taxonomical features identical with those of S. griseus. The strain resistant to wider range of aminoglycoside antibiotics than the parental strains. This multiple resistance corresponded to the activities of streptomycin kinase and acetyltransferase which were probably derived from S. griseus NP1-1. Clones with fast-growth and reduced antibiotic productivity frequently segregated from strain SK2-52, while their antibiotic resistance was stable. The results suggest that the fusion treatment caused a genetic change in S. griseus which enhanced the expression of genes for unique multiple resistance to aminoglycoside antibiotics and also induced new antibiotic production.