新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因的检测

 为系统鉴定新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因型,以新疆25个主栽杏品种为试材,利用蔷薇科保守序列设计引物对叶片基因组DNA进行SFB基因特异PCR扩增,筛选出有效的扩增引物;对成功扩增的杏品种的特异条带克隆测序,在GenBank上进行BLASTN比对,确定各品种的SFB基因型。结果显示：引物组合Ⅱ-1、Ⅳ-2,1-Ⅰ、1-Ⅱ对新疆杏品种的扩增效果最好,成功地在18个品种上扩增出了5种大小不同的条带,14种不同的基因型,其中两     

‘小白杏’自交不亲和SFB基因RNAi表达载体的构建

【目的】应用RNA干扰(RNAi)技术在分子水平调控杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】基于南疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca‘Xiaobaixing’)花粉决定子SFB(S-haplotype-specific Fbox protein)基因3’端c DNA全长序列,选取SFB基因变异区上游距起始密码子61 bp处、大小为29 bp的片段作为干扰序列,棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR(Fusion PCR)构建SFB基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihp RNA),再酶切连接到植物表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII上,构建SFB基因RNAi表达载体;用冻融转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】测序结果表明臂长29 bp、茎环242 bp的SFB基因ihp RNA结构融合成功,双酶切检验和PCR验证结果表明,该结构正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,说明SFB基因的RNAi表达载体p CAMBIA-RNAi-SFB构建成功;PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究结果表明,应用融合PCR结合酶切连接的方法构建SFB基因的RNAi表达载体是可行的,为RNAi技术在果树自交不亲和性状改良上的应用创造了条件。     

扁桃SFB基因的克隆及其生物信息学分析

以新疆扁桃栽培品种麻壳的花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个全长为1131bp的SFB基因(Genbank登录号为:EU909685),命名为AcSFB10。该基因编码376个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序。经生物信息学分析,推测AcSFB10蛋白的分子式为C2000H3033N517O558S23,相对分子质量为43985.5,等电点为6.02,二级结构以α螺旋为主;理论推导半衰期大约为30h,不稳定参数为53.21,属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起裂合酶的作用,特异性的识别底物,正好吻合了F-box蛋白的作用。     

中国杏自交不亲和花粉特异SFB基因的鉴定与序列分析

利用花粉SFB基因的同源扩增结合内切酶酶切的方法,在9个中国杏品种中首次克隆了6个花粉SFB基因,对应花柱S-RNase基因序号将其分别命名为Par-SFB8、Par-SFB9、Par-SFB11、Par-SFB17、Par-SFB23和Par-SFB26,在GenBank上的登录号分别为EU652883、EU935588、EU652884、EU652885、EU652886和EU652887。序列分析表明杏的花粉SFB基因具有蔷薇科李属植物SFB基因的典型结构特征;其内含子位于5′端非翻译区,长度90 ~ 108 bp,核苷酸序列的同源性为63.9% ~ 93.3%。氨基酸序列的同源性比较表明,杏花粉SFB基因的种内同源性为73.7% ~ 85.3%;与李属其他植物花粉SFB基因的种间同源性为75.2% ~ 97.7%。利用特异PCR扩增进一步确定了杏的S9、S11、S17和S26单元型花柱S-RNase与花粉SFB基因间距离,表明花柱S-RNase与花粉SFB基因紧密连锁;同时组织特异性表达分析确定SFB基因在花粉组织中特异表达。以上结果说明获得的SFB基因为杏的花粉候选S基因。     

2个中亚杏S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。     

杏的自交不亲和机制研究进展

被子植物的自交不亲和有孢子体型不亲和与配子体型不亲和两种类型,杏的自交不亲和属于配子体型不亲和。从生物学、细胞学和分子学角度综述杏的自交不亲和机制,对比分析研究自交亲和品种和自交不亲和品种不同的受精过程及杏的开花生物学和授粉生物学特性,为生产上花期管理、合理选配授粉树提供依据,为杏种质资源、遗传育种及生物技术等方面研究提供参考。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。     

番茄实时定量PCR内参基因选择的研究进展

实时定量PCR具有灵敏、准确、高通量等优点,已广泛应用于基因表达分析。常规的实时定量PCR关键步骤是选择合适的内参基因进行校正。该文总结了模式植物番茄传统内参基因类型的研究现状,提出了新的内参基因挖掘方法,以期为番茄实时定量PCR标准化提供了重要的理论依据。     

果树自交不亲和SFB与S-RNase作用分子机制研究进展

综述了蔷薇科果树自交不亲和性分子机制的相关研究进展,对果树自交不亲和关键基因SFB与S-RNase的生物合成与表达,序列结构特点及对应功能、作用机理及其在花柱传输组织中的相互作用等方面进行了总结,并在此基础上提出了改进修正抑制子假说的相互作用机理,以期为开展果树自交不亲和分子机制的深入研究提供基础资料。     

新疆17个杏品种的抗氧化指标与总酚含量的测定

为了研究新疆杏的遗传多样性,寻找抗氧化能力较强的功能性杏品种,为保护利用杏资源提供基础,试验采用铁离子还原法(FRAP)、二苯代苦味酰基自由基法(DPPH.)清除法和邻二氮菲-Fe2+氧化法3种方法从总抗氧化能力、DPPH.自由基清除能力和羟基自由基清除能力的角度测评了不同杏品种的抗氧化活性;用Folin-Ciocalteau法测定总酚含量。3种抗氧化指标显示:17个参试杏品种都具有强抗氧化性,并且大多数品种间差异显著,其中骆驼黄和奎克皮曼的抗氧化能力最强,不同品种间的总酚含量差异较大,变化值为1554.47μg/g,最大含量是最小含量的6.05倍,其中骆驼黄的总酚含量最高为1862.18μg/g,黑叶杏的总酚含量最低为307.71μg/g。各种抗氧化指标与总酚含量呈显著正相关,多酚类物质应该是其抗氧化的主要物质基础。     

普通杏(Armeniaca vulgaris)种质资源果实主要数量性状变异及概率分级

【目的】种质资源评价是资源研究工作的重要环节,而数量性状的合理分级是种质资源评价的基础,因此对普通杏的143～478份品种资源果实数量性状进行统计分析和概率分级。【方法】果实数量性状平均单果质量、硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖、可滴定酸、维生素C含量、核鲜质量、核干质量和仁干质量9项指标,根据K-S正态性检验和χ2检测对果实数量性状进行分级。【结果】果实数量性状的变异较为丰富,其中硬度的变异系数最大,为55.46%;可溶性固形物含量的变异系数最小,为14.95%。经K-S正态性检验对符合正态分布的数量性状统一用(X-1.2818S)、(X-0.5246S)、(X+0.5246S)和(X+1.2818S)4个点分为5级,使1～5级的出现频率分别为10%、20%、40%和20%、10%,根据χ2检测,对符合正态分布的数量性状进行概率分级。【结论】杏果实的遗传多样性丰富,将果实数量性状进行概率分级是比较理想的结果。     

Detection of miR-122 expression in serum by Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR and its clinical significance

AIM: To detect the serum level of miR-122 expression by the technique of Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR for identifying its clinical significance. METHODS: The stem-loop RT primer, PCR primer and Taqman probe of miR-122 and U6 snRNA were designed. The expression of miR-122 in the serum samples of 27 cases of preoperative hepatocellular carcinoma (HCC), 15 cases of hepatitis B, 15 cases of hepatitis C, 15 cases of healthy control (HC), 11 cases of postoperative hepatocellular carcinoma (PHCC) and 10 cases of recurrence after postoperative hepatocellular carcinoma was detected by Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR. U6 snRNA was used as the internal control. RESULTS: The results showed that the method of Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR could detect the amplification signal of serum miR-122. The expression level of serum miR-122 in the patients with HCC, hepatitis B, hepatitis C and recurrence was higher than that in HC and the patients with PHCC. Meanwhile, the serum level of miR-122 in the patients with hepatitis C was higher than that in the patients with HCC, hepatitis B and recurrence. However, no difference of miR-122 expression level among HCC, hepatitis B and recurrent patients was observed. The miR-122 level was lower in PHCC patients than that in HCC and recurrent patients. In hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and/or hepatitis B virus e antigen (HBeAg) positive patients, the miR-122 level was higher than that in the negative ones. The miR-122 level in hepatitis C antibody (HCV-Ab) positive patients was raised compared with the negative ones. The serum level of alanine aminotransferase (ALT) was positively correlated with the serum level of miR-122 (r=0.34, P<0.05). The miR-122 expression level in the patients with serum AFP≥400 μg/L was higher than that in the patients with serum AFP<400 μg/L. CONCLUSION: The method of Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR can detect the serum level of miR-122 expression. Serum miR-122 might be used as a new biomarker of liver diseases, especially in the early diagnosis of primary hepatocellular carcinoma, the curative effect of surgical operation and the prognosis.     

荔枝FLOWERING LOCUST(FT)同源基因cDNA全长克隆及其表达

应用RT-PCR方法在首次克隆获得荔枝AP1同源基因cDNA全长基础上,又得到2个荔枝FT同源基因cDNA全长,分别命名为LcFT1和LcFT2(基因登录号分别为:JN214350、JN214351)。LcFT1基因开放阅读框522 bp,编码174个氨基酸,推测蛋白质分子质量为19.65 ku,等电点为8.68。LcFT2基因开放阅读框522 bp,编码174个氨基酸,推测蛋白质分子质量为19.56 ku,等电点为7.34。蛋白质二级结构预测表明,LcFT1和LcFT2蛋白都具有4个α螺旋,10个β折叠区。同源分析表明,LcFT1和LcFT2基因在不同植物中的一致性为72%～82%。半定量RT-PCR分析表明,三月红荔枝花芽分化期LcFT1和LcFT2基因只在叶中表达,并且在成熟叶中表达量最多。研究将有助于进一步了解荔枝开花的分子机理及其成花的生物学发育过程。     

山核桃实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

[目的]筛选出山核桃中的最佳内参基因.[方法]以山核桃的根、茎、叶、柱头、果皮、胚、不同处理下的叶片及嫁接后的砧木和接穗为试验材料,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder4种软件对10个管家基因家族(ARF、ACT1、ACT7、MPS、UBC9、CYP、60SRP、EF-1α、...     

李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析

【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类,为病毒的分子检测提供基础。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒(PNRSV)。以阳性样品的总RNA为模板进行PNRSV外壳蛋白基因(CP)RT-PCR扩增,对预期430 bp大小的4个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。【结果】结果表明,PNRSV新疆巴旦木分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高的同源性,分别为80.0%～97.2%和80.1%～94.1%,其中与阿根廷分离物AY217的同源性最高;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(ApMV)同源性较低,仅为52.9%～55.4%和45.6%～48.6%。新疆PNRSV各分离物之间CP基因高度同源。序列比对与系统发生树的分析显示,PNRSV新疆巴旦木分离物的株系属于GroupⅠ组。【结论】确定了PNRSV为侵染新疆巴旦木果树的病原病毒。这是PNRSV在新疆发现的首次报道。     

蜡梅快速碱化因子基因CpRALF 的克隆及表达分析

 通过随机克隆测序的方法从蜡梅花cDNA文库中获得快速碱化因子基因,命名为CpRALF（GenBank登录号为：JQ217379）。扩增获得的DNA序列与cDNA序列一致,表明该基因不具有内含子,包含一个384 bp的最大开放阅读框,编码一个长127个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有快速碱化因子特有的YIXY、YXRGC和4个保守的半胱氨酸以及双精氨酸结构。实时荧光定量PCR分析表明该基因在蜡梅茎、根和盛开的全花中表达量较高;在花发育过程中,蕾期和衰败期表达丰度高。在对蜡梅幼苗进行高温、低温、高盐、重金属4种非生物胁迫处理后,通过实时荧光定量PCR对CpRALF在幼叶中的表达量进行分析,结果表明高温、高盐和重金属能够促进该基因表达,而低温则抑制该基因的表达,且CpRALF对高盐与重金属胁迫的响应比对高温和低温胁迫的响应更为显著和迅速,表明该基因可能在蜡梅花发育以及非生物胁迫反应响应方面发挥作用。     

北柴胡鲨烯合酶基因及其编码区cDNA克隆与序列分析

鲨烯合酶(EC.2.5.1.21,squalene synthase,SS)是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。为研究鲨烯合酶在柴胡皂苷生物合成中的作用,以北柴胡(Bupleurum chinense DC.)不定根为试材,采用Trizol法提取总RNA,利用RT-PCR方法从北柴胡中扩增出了鲨烯合酶cDNA特异片段,并进行了克隆、测序。测序结果显示得到了两个序列不同的cDNA(BcSS1和BcSS2),分别为1245bp和1248bp,分别编码414及415个氨基酸。BcSS1和BcSS2间的核苷酸和氨基酸一致性分别为98%和96%。NCBI Blastx结果显示与三岛柴胡和三七SS氨基酸序列相似性最高,BcSS1的一致性分别为99%和90%,BcSS2的分别为97%和87%。在此基础上,利用PCR技术从北柴胡不定根中扩增得到了一个SS基因克隆,长5880bp,包含12个内含子。