溃疡性结肠炎大鼠iNOS真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠结肠组织中i NOS基因的真核表达载体,并表达于COS-7细胞,以便进一步研究i NOS在UC发病机制中的作用。方法:从溃疡性结肠炎大鼠结肠组织提取总RNA,经逆转录获得cDNA,以PCR方法克隆i NOS的基因片段,并对其序列进行测定。将测序正确的i NOS编码序列插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO中,构建真核表达载体;采用脂质体法转染COS-7细胞,用倒置荧光显微镜和Western blot的方法观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescence protein,GFP)的表达。结果:PCR方法扩增出3598bp的基因片段,插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO构建真核表达载体后,经以质粒为模板的PCR扩增和测序鉴定表明,克隆出UC大鼠结肠组织i NOS的编码序列同GeneBank收录的序列一致。将重组体转染COS-7细胞后,倒置荧光显微镜观察到绿色荧光,Western blot检测表明细胞中可表达融合蛋白。结论:本研究成功构建了pcD-NA3.1/CT-GFP-TOPO-i NOS重组质粒,并能高效转染COS-7细胞,为下一步i NOS基因功能研究及其在UC发病机制中的研究奠定了基础。     

人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建含人cD81基因的真核表达载体，探讨CD81在COS-7细胞的表达，为研究丙型肝炎病毒(1-ICV)与cD81相互作用奠定基础．方法：从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81，应用双酶切回收基因片段，定向克隆入真核表达载体pVAX1；通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞；应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物．结果：重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确，并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白．结论：成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81，并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子，该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型．     

RAI16基因真核表达载体的构建及在HepG2中的表达

72 h后,RAI16基凶在蛋白水平的表达逐渐增高,而AFP的表达逐渐下调.结论 成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-RAI16,并在HepG2细胞中进行了表达.     

hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位。结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2 058 bp,并测序成功。Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105 kDa。pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。     

CD2AP在大鼠肾病模型中的表达及意义

目的：观察CD2-associated protein(CD2AP)在大鼠氨基核苷肾病模型。肾小球中的表达变化及其意义。方法：通过建立大鼠氨基核苷肾病模型，采用免疫组织化学技术观察CD2AP在不同时间点。肾病模型大鼠。肾小球中的表达和分布变化。结果：①。肾小球足细胞CD2AP的表达在。肾病模型建立的早期即有下调；在大鼠肾病模型蛋白尿的高峰期，CD2AP的表达明显下降；在肾病模型大鼠的疾病恢复期，CD2AP的表达逐步恢复正常；②肾小球足细胞CD2AP表达量的变化与肾病模型大鼠24h尿蛋白定量的变化存在着负相关。结论：①CD2AP是判断。肾小球足细胞损伤的一个早期重要指标；②CD2AP在足细胞中表达量的改变可能是肾小球滤过屏障功能异常的病理生理基础。     

人CD154基因绿色荧光真核表达载体的构建

目的构建携人CD154基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN3-CD154。方法体外PHA激活人外周血单个核细胞，提取总RNA，用RT-PCR技术扩增人CD154cDNA全长开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—TEasy载体，再定向克隆至增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N3，重组质粒pEGFP-N3-CD154用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果多种鉴定方法证实了重组载体中的CD154基因序列与已知的序列一致。结论成功构建了携带人CD154基因的重组的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3-CD154，为进一步研究人CD154基因转染细胞在肿瘤免疫治疗中的生物学意义提供初步的实验基础。     

pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达载体的构建及在心肌细胞内的表达

目的：构建plRES2-EGFP-hVEGF165真核表达质粒并在心肌细胞内表达．方法：应用限制性内切酶将目的片段VEGFl65克隆入含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒plRES2-EGFP中．转染心肌细胞后，应用荧光显微镜检测EGFP的表达，以免疫组化法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在体及离体表达．结果：构建了真核共表达载体plRES2-EGFP-hVEGF165．转染心肌细胞后，荧光显微镜观察可见EGFP的表达，免疫组化染色证实细胞内有VEGF的表达．结论：外源性hVEGF165基因可在心肌细胞内稳定表达．     

鼠伯氏疟原虫CSP基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

目的分别构建携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)环子孢子(CSP)全长基因和去除中央重复序列的CSP的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在Hela细胞中的表达。方法采用PCR技术,从伯氏疟原虫基因组中扩增全长CSP基因,将其定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP全长基因重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定;同样,采用PCR技术扩增PbCSP的N端和C端两个片段,先将C端片段定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP-C重组质粒,再将PbCSPN端片段定向克隆入pEGFP/PbCSP-C,构建pEGFP/PbCSP'重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定。将pEGFP/PbCSP和pEGFP/PbCSP′分别用脂质体介导转染体外培养的Hela细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测融合蛋白的表达。结果PCR、酶切及测序证实目的基因PbCSP全长和片段分别正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,两种重组质粒转染Hela后,荧光显微镜及RT-PCR均检测到目的蛋白在Hela中表达。结论成功构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫CSP全长基因和该基因片段的融合蛋白真核表达质粒,并在Hela细胞中获得表达。     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

荧光表达载体Podocin过表达对HEK293细胞中CD2AP分布的影响

目的:构建podocin荧光表达载体,并观察其转染HEK293后对CD2AP细胞内分布的影响.方法:PCR扩增NPHS2eDNA全长,通过T/A克隆连接至pGEMT-easy载体,应用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,再将NPHS2全长亚克隆人pEGFP-C2.将构建好的荧光表达载体pEGFP-NPHS2转染HEK293细胞,通过免疫荧光的方法观察转染前后CD2AP细胞内的分布情况.结果:①成功构建pEGFP-NPHS2荧光表达载体;②Podocin表达载体转染HEK293细胞后,CD2AP由核周转为弥散的细胞质分布.结论:Podocin转染HEK293细胞可使CD2AP由核周转为弥散的细胞质分布.     

葡萄糖激酶基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的构建葡萄糖激酶（GK）基因真核表达载体并于COS-7细胞内表达，为体外构建具有葡萄糖刺激性胰岛素分泌能力的基因工程细胞奠定基础。方法质粒pCMV4-GKZ1以EcoRI、BamHI双酶切，获得GK cDNA，与同样酶切的pcDNA3．1载体连接，建成重组载体pcDNA3．1-GKZ1，经酶切与测序鉴定。Lipofectamine2000介导pcDNA3．1-GKZ1转COS-7细胞。分别以RT—PCR及Western-blot对COS-7／GKZ1细胞中GKZ1基因的转录及表达进行检测。结果构建的pcDNA3．1-GKZ1重组载体经酶切有1450bp的GKZ1 cDNA，序列经测序证实。COS-7／GKZ1细胞RT—PCR扩增出498bp的目的片段，Western—blot可见54kDa的特异性条带，而COS-7／pcDNA3．1细胞上述各项检测结果均为阴性。结论成功构建GK基因真核表达载体pcDNA3．1-GKZ1，并于COS-7细胞中成功转录与表达。     

人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达

目的:从人类乳腺癌耐多柔比星细胞株细胞(MCF-7/Adr)中克隆CD44基因并构建CD44基因真核表达载体pcDNA3.1-CD44;将pcNDA3.1-CD44稳定转染入人乳腺癌细胞株(MCF-7)细胞中.方法:从MCF-7/Adr细胞中提取总RNA进行RT-PCR,获得全长的cDNA模板;将含有CD44基因的cDNA模板使用限制性内切酶进行双酶切获得带有酶切位点的CD44基因,再将带有酶切位点的CD44基因经TA克隆后测序验证,然后亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,双酶切鉴定后再次测序验证.脂质体法将pcDNA3.1-CD44质粒转染到MCF-7细胞中,48小时后RT-PCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF-7细胞的表达变化.结果:成功从人MCF-7/Adr细胞中克隆获得CD44基因并构建真核表达载体,转染后在MCF-7中检测到CD44基因mRNA和蛋白水平表达上调;将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF-7细胞经G418筛选两周后获得阳性克隆.结论:成功克隆和建立人CD44基因真核表达质粒;pcDNA3.1-CD44能在MCF-7细胞中表达;在MCF-7/Adr中新发现一种CD44基因的变异体(基因库号FJ216964);这为进一步研究其基因功能打下了基础.     

阿霉素肾病大鼠肾组织中nephrin和CD2AP的表达及意义

【目的】 动态观察nephrin。CD2相关蛋白(CD2AP)在阿霉素肾病大鼠肾小球中的表达变化,探讨其在蛋白尿发生发展过程中的作用。【方法】 72只大鼠分为2组,模型组36只和对照组36只,模型组大鼠尾静脉一次性注射盐酸阿霉素,对照组大鼠尾静脉一次性注射等容积生理盐水,分别于注射后3。5。7。14。28。42 d各杀检6只大鼠。采用实时荧光定量PCR。免疫组织化学检测大鼠肾小球中nephrin。CD2AP的表达和分布变化。【结果】 ①模型组大鼠7 d时nephrin mRNA表达增加,14 d时其蛋白表达(9.44 ± 0.49)亦显著增加;CD2AP表达增加时间较晚,28 d时其mRNA和蛋白表达(7.88 ± 1.01)才显著增加。②与对照组相比,模型组nephrin。CD2AP出现分布异常,从沿着毛细血管袢线样分布逐渐转变为不连续性颗粒样或斑片状分布。③肾小球nephrin mRNA。CD2AP mRNA表达量与24 h尿蛋白量均呈正相关关系(r = 0.878, P < 0.01; r = 0.945, P < 0.01)。【结论】 ①nephrin早期出现表达增加及分布异常,可能是导致蛋白尿的原因及判断肾小球足细胞损伤的一个早期重要指标。②CD2AP在后期出现表达增加,可能是足细胞抵抗损伤的一种代偿反应。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS 7细胞 ,用RT PCR和流式细胞术 (FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果 :重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS 7细胞中获得表达。结论 :成功地构建了重组表达载体pcD NA3.1 NKG2D ,并实现了在COS 7细胞中的瞬时表达 ,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的：构建人NKG2D重组真核表达载体，并研究其在COS-7细胞中的表达。方法：应用RT-PCR，自健康人外周血单个核细胞(PBMC)中获取NKG2D cDNA，应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后，构建含目的基因的真核细胞表达质粒，并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS-7细胞．用RT-PCR和流式细胞术(FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果：重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS-7细胞中获得表达。结论：成功地构建了重组表达栽体pcDNA3．1-NKG2D，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

人CD137分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人CD17分子的编码序列，将其重组人真核表达载体，并表达于COS－7细胞，方法：从活化的T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人CD137的编码序列，对其序列进行测定。将测定正确的CD137编码序列克隆入真核表达载体PCI－neo，构建重组表达载体。采用质体法转染COS－7细胞，用流式细胞仪检测CD137分子的表达。结果：PCR方法扩增出一800bp左右的基因片段，插入PCI－neo构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为人CD137编码序列，将重组子转染COS－7细胞，流式细胞仪检测显示有27．11％的细胞表达人CD137分子。结论：成功地克隆并在COS－7细胞中表达了CD137分子。     

CD146短发夹RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 CD146基因表达增高与涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)的临床症状相关.为进一步研究CD146基因的功能,构建人CD146短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并鉴定.方法 根据Genebank中靶基因CD146序列,按照Tuschl设计原则,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pGenesil-1载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定.结果 经过限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定,证实重组质粒pGe-CD146-shRNA的序列正确.结论 成功构建了靶向人CD146基因的shRNA真核表达载体系统,为进一步研究CD146基因的功能奠定了实验基础.