SYBR Green II荧光定量PCR结合熔解曲线鉴别不同亚型兔病毒性出血症病毒方法的建立

本研究建立了一种荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)结合熔解曲线区分不同亚型兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)方法。根据GenBank数据库中已公布的不同亚型RHDV(经典RHDV和RHDV2)的衣壳蛋白VP60序列保守区设计了1对特异性引物,利用SYBR Green II荧光染料,在实时荧光定量PCR方法的基础上结合熔解曲线进行分析,经典RHDV和RHDV2熔解温度(Tm)分别为(86.3±0.1)℃和(85.1±0.1)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现单特异峰。结果表明,本研究建立的方法能够快速地鉴别经典RHDV和RHDV2。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。     

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒（NDV）核苷酸序列，设计针对中、强毒力NDVF基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针，建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR（RRT—PCR）检测中、强毒力NDVRNA的方法。该方法能从舍有NDVI系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9（基因Ⅸ型）、分离鸡源强毒株（基因Ⅶ型）和鸽源强毒株（基因VI型）样本中检出NDVRNA，不与NDV弱毒株（LaSota、Clone30、B1、V4）、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒及健康鸡组织RNA发生交叉反应，对NDV核酸的最小检出量为60个拷贝，具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等特点。从9个临床样本中均检测出阳性信号（9／9），PCR产物经测序证明均舍有NDV强毒株F基因裂解位点；用其中8份病料接种SPF鸡胚分离病毒，分离率为5／8。     

猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法的建立与检测

本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PPV NS1基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本次建立的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。     

采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法对猪瘟强毒与疫苗弱毒的鉴别研究

为建立一种能够区分猪瘟病毒(CSFV)强毒与弱毒疫苗C株的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法,本研究对GenBank中登录的25株CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗C株全基因组序列进行比较分析,设计一对共用下游引物以及分别针对CSFV强毒株与弱毒疫苗的特异性上游引物,其Tm值分别为84.5±0.5℃和88.5±0.5℃,熔解曲线分析显示为单特异峰.检测结果显示本实验建立的鉴别CSFV强毒感染与弱毒疫苗的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法特异性强,对其他相关病毒无特异性扩增;敏感性高,最低检出量为5×RID50的细胞疫苗基因组拷贝;重复性好;并且扩增效率高、线性范围广、检测时间短,可对免疫猪群中CSFV强毒感染做出快速准确的鉴别检测,为有效防制猪瘟提供依据.     

鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank上鸡β-actin基因的序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green I染料建立了荧光定量PCR法（real-time PCR）。以常规PCR产物为标准品，建立了标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，标准曲线Ct值检测范围为12~31,扩增效率为95.1%；熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰，其Tm为88±0℃，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短，为β-actin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。     

SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法快速鉴定新城疫病毒毒力

为快速鉴定不同新城疫病毒株(NDV)毒力,我们以NDV F蛋白裂解位点附近的基因序列自行设计1对引物,对不同毒力NDV毒株进行荧光RT-PCR扩增,根据其扩增效率及扩增产物熔解温度(Tm)值大小进行NDV毒株毒力的鉴定,建立了能区分NDV强弱毒株的SYBR GreenI荧光RT-PCR方法;同时将其与鸡胚平均致死时间(MDT)测定和F蛋白裂解位点序列分析结果进行比较。结果发现:建立的SYBR Green I荧光RT-PCR方法只需4 h即可判定结果,NDV强弱毒株扩增产物Tm值为(83±0.5)℃且有2个峰值,阴性对照Tm值为(81±0.5)℃且只有1个峰值;对NDV强毒株的扩增效率即Ct值在11~20之间,NDV弱毒株Ct值在25~30之间,阴性对照Ct值在30以上,Ct值在20~25之间为强弱毒株混合物。该方法检测结果与MDT测定和F蛋白裂解位点分析结果一致。应用SYBR Green I模式荧光RT-PCR方法与普通RT-PCR方法和鸡胚接种鉴定方法分别对80份临床组织样品进行检测,强毒株的检出率均为53.75%(43/80),而弱毒株的检出率相应为31.25%(25/80)、27.50%(22/80)和35.00%(28/80),检出符合率达89.3%以上。这些结果表明建立的SYBR Green I荧光RT-PCR方法具有特异、准确、快速等特点,可用于临床病料样本NDV毒株的毒力鉴定。     

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒(NDV)核苷酸序列,设计针对中、强毒力NDVF基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针,建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR(RRT-PCR)检测中、强毒力NDVRNA的方法。该方法能从含有NDVⅠ系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9(基因Ⅸ型)、     

猪伪狂犬病病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究根据猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的gE基因序列特点,设计特异性实时荧光定量引物,建立基于SYBR GreenⅠ染料的猪PRV实时荧光定量PCR方法。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法检测猪PRVgE基因在7.53×10~1~7.53×10~6拷贝/μL范围内有较好的线性关系;对猪圆环病毒(porcine circovirus2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和猪链球菌(Streptococcus susi)核酸均未见阳性扩增信号;从生成的熔解曲线可见,建立的方法仅对猪PRV检测出现单一特异峰,其熔解温度(Tm值)为(92.9±0.1)℃,PCV2、PPV、副猪嗜血杆菌和猪链球菌均未见特异性峰值;建立的实时荧光定量PCR方法的组内和组间变异系数分别为0.31%~1.14%和0.42%~1.74%。以上结果表明,本研究建立的猪PRV实时荧光定量PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为深入开展猪PRV对宿主致病机制的研究提供检测手段。     

鸭IFN-γ mRNA实时荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测鸭IFN-γmRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green I染料,建立检测鸭IFN-γmRNA的实时荧光定量RT-PCR方法(real-ti me RT-PCR)。试验以PCR产物为标准品,建立标准曲线,随后进行熔解曲线分析和稳定性研究。结果Ct值线性范围为12.0~33.0,相关系数为0.997;熔解曲线显示产物为单特异峰,Tm为82.5±0℃;组内变异系数(CV%)为4.26%;组间试验无显著差异(P>0.05)。建立的检测鸭IFN-γmRNA的Real-ti me RT-PCR方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。     

猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立

参照GenBank登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增伪狂犬病毒(PRV)gH基因与猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PCV2ORF2基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果显示,PCV2与PRV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.8℃和86.7℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达215拷贝/μL和180拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。结果表明,建立的PCV2与PRV荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PCV2混合感染的临床病料进行快速诊断。     

利什曼原虫实时荧光定量PCR方法的建立

以利什曼原虫的小环状动基体DNA(Leishmaniak DNA)为靶基因,建立实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法。根据GenBank报道的利什曼原虫小环状动基体DNA保守序列设计合成特异性引物,经PCR扩增后与pMD18-T载体连接,转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑选阳性克隆重组质粒经鉴定正确后,作为模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.996,而且特异性强,重复性好。本研究成功建立了实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法,该方法可用于利氏曼原虫病的诊断、流行病学监测和科学研究。     

猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法的建立

参照GenBank登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增伪狂犬病毒（PRV）gH基N与猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因的部分片段。将测序正确的PRVgH基因与PCV2ORF2基因片段克隆入pGEMTEasy载体,转化大肠杆菌DH5a,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBRGreenI荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果显示,PCV2与PRv荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80．8℃和86．7℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达215拷贝／μL和180拷贝μL,是普通PCR检测方法的100倍。结果表明,建立的PCV2与PRV荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PCV2混合感染的临床病料进行快速诊断。     

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。     

番鸭IFN-α mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭IFN-α基因(GenBank登录号:JF894229)序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因(GenBank登录号:GU564232)为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法(RT-PCR)。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品(p-IFN-α和p-β-actin),分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99(r>0.99),扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为(93.6±0.26)℃和(85.3±0.15)℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒Ⅱ系与Ⅳ系毒株SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)Ⅱ系与Ⅳ系毒株SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR的鉴别检测方法，针对PPRV-H基因的高变区域设计1对特异性引物，确定反应条件，分析其敏感性和特异性，并对临床样本进行验证。60℃退火、76℃收集荧光信号获得试验效果最好，熔解曲线为单一峰，Ⅱ系毒株熔解温度78.63℃,Ⅳ系毒株熔解温度80.08℃,易于区分；最低检测限为10拷贝/μL,批内、批间变异系数均小于0.5%,羊口疮病毒(ORFV)等4种病毒无扩增曲线产生；检测140份临床样本，与国家标准检测方法结果符合率100%。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR检测方法可以快速、灵敏和特异地鉴别检测出PPRVⅡ系与Ⅳ系毒株，满足疫病快速诊断的需求。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Gen Bank登录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）毒株（登录号KJ960180）的M基因保守序列,设计1对扩增片段大小为299 bp的特异性引物,经PCR扩增、克隆、测序鉴定后,提取质粒作为阳性标准品,建立了PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法在1.21×10^3~1.21×10^8拷贝/μL范围内呈现良好的线性,相关系数（R2）为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线为单个特异峰,产物Tm值为85.5~86℃,最低检测限为1.21×10^1拷贝/μL。本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、成本低且操作简单,适用于PEDV的早期诊断、定量研究和流行病学监测。     

鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL~(-1)时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL~(-1);特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。     

鉴别诊断鸡传染性法氏囊病RT-PCR方法的建立

诊断鉴别鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)对该病的临床诊治具有重要意义。从IBDV弱毒疫苗中提取病毒RNA,采用二步RT-PCR方法,建立诊断和鉴别IBDV毒株性质的分子诊断方法。结果表明:针对IBDV VP2基因高变区的基础RT-PCR引物和巢式RT-PCR引物,分别能够扩增出目标大小的特异性片段;区分IBDV超强毒株和经典毒株的RT-PCR扩增结果与预期目标一致。该方法可用于鸡传染性法氏囊病毒病的快速分子诊断及鉴别。     

鹅圆环病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为54.10拷贝/μL;特异性好,与水禽常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅GoCV出现1个特异性单峰,Tm值为（84.46±0.09）℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.26%～0.55%和0.23%～0.87%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时对64份临床样品进行GoCV感染的检测,结果显示,常规PCR方法检出阳性样品15份,阳性率为23.44%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品18份,阳性率28.13%,且15份PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展GoCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。