不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异

目的：观察不同条件对人脐血间充质于细胞培养的影响。方法：实验于2004—10／2005—10在首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。①用复方枸橼酸血液保存液和肝素钠两种不同的抗凝血剂保存的人脐带血，经密度梯度离心法分离新鲜脐带血，获取的单个核细胞，经椎虫蓝染色进行活细胞计数，比较所获得的单个核细胞数。②用不同密度1&;#215;10^9L^-1，2&;#215;10^9L^-1,5&;#215;10^9L^-1接种单个核细胞，倒置显微镜下观察细胞形态。用流式细胞仪检测所培养的细胞免疫表型。③分别用高糖和低糖DMEM培养液（含体积分数0．1的胎牛血清）培养单个核细胞，其他条件相同，从72h后对所形成的细胞克隆进行计数，对两种培养基形成的细胞克隆和生长状况进行比较。结果：①不同抗凝血剂抗凝的人脐带血所获得的单个核细胞数及细胞生长状态：用肝素钠抗凝血剂保存的人脐带血所获得的单个核细胞数和细胞生长状态明显优于用复方枸橼酸血液保存液保存的人脐带血（P〈0．05）。②不同接种密度人脐血间充质干细胞的贴壁生长状态及人脐血间充质干细胞的免疫表型：较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞，而以5&;#215;10^9L^-1密度接种，72h后单个核细胞开始贴壁并开始形成细胞克隆，在10d后出现梭形细胞，培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。用流式细胞仪检测所培养的细胞为非造血间充质干细胞。③两种培养基形成的细胞克隆数和生长状况：在10d以后，用低糖DMEM组培养的单个核细胞形成的细胞克隆数与高糖DMEM组相比较差异有显著性意义（P〈0．05）。结论：①肝素钠作为人脐带血保存液能获得大量的单个核细胞，有利于人脐血间充质干细胞的培养。②5&;#215;10^9L^-1。细胞接种密度有利于人脐血间充质干细胞贴壁生长。③用低糖DMEM作为培养人脐血间充质干细胞的培养基有利于细胞克隆的形成和维持，对保持人脐血间充质干细胞特性有良好作用。     

脐血间充质干细胞体外培养方法的改良及其成骨分化能力

目的:采用两种改良方法体外分离培养脐血间充质干细胞,并观察其成骨分化能力。方法:实验于2006-05/09在上海交通大学医学院附属第九人民医院骨与关节中心细胞实验室完成。①所用28份脐血标本由复旦大学医学院附属妇产科医院提供,取自足月健康顺产新生儿,产妇和家属均书面同意,实验经医学伦理委员会批准。②采集28份脐血标本,50～90mL/份,枸橼酸抗凝。采集后12h内密度梯度离心法分离出单个核细胞,接种于100mm×20mm培养皿中,细胞浓度为1×1010L-1,置于含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养液中原代培养,5～7d后半量换液,后每隔3～4d全量换液一次。③细胞贴壁后,分两组予以改良培养。改良1组10份,当培养皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的培养皿中培养;改良2组18份,待培养皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基更换为含体积分数为0.15小牛血清的α-MEM,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基。成纤维样细胞融合至80%～90%时胰酶消化,按1∶2或1∶3传代培养。④显微镜下观察脐血间充质干细胞的形态。取第5代脐血间充质干细胞,采用流式细胞仪测定细胞免疫表型,以碱性磷酸酶法检测成骨分化能力。结果:①28份脐血间充质干细胞中,共20份原代培养中出现贴壁细胞(改良1组6份,改良2组14份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率46.4%。②原代培养5～7d后贴壁细胞呈梭形成纤维样细胞和圆形巨核细胞。改良1组与2组于原代培养5周可见成纤维样细胞集落,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,传至22代形态无明显变化。③可强烈表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志,而不表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志。④成骨诱导1周,脐血间充质干细胞可分化为成骨细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性。结论:脐血中存在的单个核细胞经过改良培养后,可提高脐血间充质干细胞的培养成功率。脐血间充质干细胞具有与其他来源的单个核细胞类似的表型及成骨分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定。     

不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异

目的:观察不同条件对人脐血间充质干细胞培养的影响。方法:实验于2004-10/2005-10在首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。①用复方枸橼酸血液保存液和肝素钠两种不同的抗凝血剂保存的人脐带血,经密度梯度离心法分离新鲜脐带血,获取的单个核细胞,经椎虫蓝染色进行活细胞计数,比较所获得的单个核细胞数。②用不同密度1×109L-1,2×109L-1,5×109L-1接种单个核细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。用流式细胞仪检测所培养的细胞免疫表型。③分别用高糖和低糖DMEM培养液(含体积分数0.1的胎牛血清)培养单个核细胞,其他条件相同,从72h后对所形成的细胞克隆进行计数,对两种培养基形成的细胞克隆和生长状况进行比较。结果:①不同抗凝血剂抗凝的人脐带血所获得的单个核细胞数及细胞生长状态:用肝素钠抗凝血剂保存的人脐带血所获得的单个核细胞数和细胞生长状态明显优于用复方枸橼酸血液保存液保存的人脐带血(P<0.05)。②不同接种密度人脐血间充质干细胞的贴壁生长状态及人脐血间充质干细胞的免疫表型:较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞,而以5×109L-1密度接种,72h后单个核细胞开始贴壁并开始形成细胞克隆,在10d后出现梭形细胞,培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。用流式细胞仪检测所培养的细胞为非造血间充质干细胞。③两种培养基形成的细胞克隆数和生长状况:在10d以后,用低糖DMEM组培养的单个核细胞形成的细胞克隆数与高糖DMEM组相比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:①肝素钠作为人脐带血保存液能获得大量的单个核细胞,有利于人脐血间充质干细胞的培养。②5×109L-1细胞接种密度有利于人脐血间充质干细胞贴壁生长。③用低糖DMEM作为培养人脐血间充质干细胞的培养基有利于细胞克隆的形成和维持,对保持人脐血间充质干细胞特性有良好作用。     

脐血来源的间充质干细胞生物学特性与向成骨细胞分化能力的研究

目的研究人脐血来源的间充质干细胞（UCBMSC）的免疫表型、生物学特性及其向成骨细胞分化的能力。方法分离脐血单个核细胞，以干细胞培养液培养间充质干细胞（MSC），观察其体外生长特性；用流式细胞术进行免疫表型测定和细胞周期分析；以含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的诱导液定向诱导向成骨细胞分化；以碱性磷酸酶染色、矿化结节染色、骨桥蛋白mRNA的表达以及I型胶原表达鉴定MSC向成骨细胞分化的潜能。结果从脐血中可以培养出MSC，为成纤维细胞样的贴壁细胞。免疫表型分析显示CD45、CD34、CD11a、CD14、HLA．DR阳性细胞占1％～3％；CD166、CD44、CD106、CD29、CD105、CD49e、CD90、CD73表达率达91％～98％。细胞周期分析显示95％以上的细胞处于G0／G1期。定向成骨细胞诱导后，可以检测到碱性磷酸酶、I型胶原的表达，矿化结节的形成和骨桥蛋白mRNA的表达。结论UCBMSC是基质细胞的祖细胞，在合适的条件下可被诱导向成骨细胞分化，因此有可能作为有潜力的骨组织工程的种子细胞来源。     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及其影响因素

背景:多潜能间充质干细胞在特定的培养条件下可以分化为骨、脂肪、软骨、肌肉以及内皮细胞,是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞。目的:建立人脐带血来源的间充质干细胞体外培养、扩增的方法,并分析其影响因素。设计:随机对照实验。单位:无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室。材料:健康新生儿脐带血(来源于无锡第三人民医院妇产科临产室,均征得产妇及其家属同意)70例,每例40mL;低糖基本必需培养基(Gibco),胎牛血清(Gibco),青链霉素(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),FITC标记的小鼠抗人CD29、CD105、CD106(Ancell)单克隆荧光抗体和PE标记的小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD19、HLA-DR(Immunotech)单克隆荧光抗体,Ficoll分离液(Pharmacia)。方法:实验于2005-02/2005-12在无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室完成。①脐血间充质细胞的分离培养:健康新生儿脐带血共70例肝素(25u/mL)抗凝,分离单个核细胞,其中60例沉淀细胞用细胞培养液(低糖基本必需培养基 50g/L胎牛血清 10g/L青链霉素)重悬,另10例用高糖基本必需培养基重悬(其余培养条件相同)。细胞长到80%融合时,以1.0×107个/L的密度接种于培养瓶中进行扩增培养。②胎牛血清包被对人脐血间充质干细胞贴壁率的影响:取生长状态良好、纯化后对数生长期的人脐血间充质干细胞,分为血清包被组和无血清包被组,分别观察其贴壁率。③间充质干细胞的形态学和生长曲线:在相差显微镜(OLYMPUS CK40)下观察细胞生长状况,数码成像系统(OLYMPUS DP50)摄像记录。④免疫表型:取扩增第5代的脐血间充质干细胞,用EPICS-ALTRA流式细胞仪进行检测。主要观察指标:①观察高糖组和低糖组细胞的生长状态。②观察不同时间点胎牛血清包被组与未包被组细胞的贴壁情况并分别计算贴壁率。结果:本实验总共培养和分析了70例脐血间充质干细胞样本。由于10例予含高糖的培养基培养的标本均未获得理想的间充质干细胞,故未进行统计学分析。①按照本实验所建立的培养体系,约20%的样本成功培养出脐血间充质干细胞。原代细胞在培养2周后可达到融合,一般其倍增时间为3～4d,传代后7～8d即可达到融合。②扩增至第5代的间充质干细胞结果显示,脐血间充质干细胞均一稳定地表达间充质干细胞相关的抗原标记:CD29,CD44,CD105,但不表达CD34,CD45,CD106,HLA-DR,这与源于骨髓的间充质干细胞的表面抗原标记相一致。③血清包被组间充质干细胞贴壁率显著高于无血清包被组(P<0.01)。结论:脐带血中的间充质干细胞可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。高糖可能抑制人脐血间充质干细胞的生长和扩增。     

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化

背景:研究报道显示人脐带间充质干细胞体外分离方法及效率、培养条件各不相同,并且尚未有统一的鉴定标准.因此建立高效、经济的培养体系十分必要.目的:建立从人脐带组织分离培养间充质干细胞的方法,并进行向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化.方法:采用组织块贴壁法和酶消化法分离纯化获得人脐带间充质干细胞,取对数生长期的第3代细胞,分析其细胞形态、增随方式和某些免疫表型,并在体外诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化.结果与结论:采用组织块贴壁法和酶消化法均能成功获得贴壁生长的人脐带间充质干细胞,并在体外扩增培养.流式细胞术分析结果显示,人脐带间充质干细胞强表达CD29,CD44,CD59,CD105,阴性表达CD28,CD31,CD34,CD45,CD40,CD86,HLA-DR.人脐带间充质干细胞在适当的诱导条件下能向脂肪和成骨细胞分化,体外能连续传代40次以上,且形态和表型保持稳定.这证实了人脐带组织存在间充质干细胞,且具有向脂肪和成骨细胞分化的潜能,因此将可能成为细胞治疗和组织工程新的种子细胞.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化成骨细胞的实验研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及诱导分化成骨细胞的潜能。方法采用Perco密度梯度离心和贴壁细胞法对MSCs进行分离培养,并观察其形态学特征。在诱导剂诱导作用下,通过形态学观察,采用免疫组化法检测细胞CD44,CD54表型,钙钴法检测ALP活性,Von-Kossa法矿化结节染色,RT-PCR扩增成骨细胞中CBFA I基因表达。结果采用Perco分离的MSCs,CD44,CD54表达阳性,经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,ALP合成增多,活性增加,Von-Kossa法矿化结节染色阳性,RT-PCR扩增出165bp CBFA I基因转录片段。结论体外分离纯化培养的MSCs经成骨诱导剂诱导后能向成骨细胞方向分化增殖。     

脐血间充质干细胞培养体系的建立

目的:寻找脐带血来源的间充质干细胞体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要。方法:实验于2005-06/2006-04在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成。脐带血36份,50～60mL/份,取自青岛大学医学院附属医院产科健康产妇正常足月顺产或剖宫产分娩婴儿的脐带血,经产妇本人及家属同意。无菌条件下取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。16份脐血每份分为3组,分别以间充质干细胞接种密度1×107L-1、1×109L-1、1×1011L-1接种于未包被6孔培养板内,加入5%胎牛血清的DMEM-LG培养。20份脐血每份分为3组,以1×1011L-1单个核细胞密度分别加入5%、10%和20%胎牛血清的DMEM-LG接种于胎牛血清包被的6孔培养板内培养。采用常规的间充质干细胞培养Friedenstein法进行脐血间充质干细胞的培养和扩增培养。观察不同脐血单个核细胞的接种密度、培养液胎牛血清浓度和胎牛血清包被培养皿对间充质干细胞培养的影响。结果:①胎牛血清未包被组以1×107L-1和1×109L-1接种组培养7d后贴壁数量很少,贴壁的细胞未长满瓶底即死亡,无法传代。1×1011L-1组贴壁细胞较多,间充质样细胞与破骨样细胞并存。1×1011L-1组分5%、10%、20%3种血清浓度,贴壁细胞均较多,以间充质干细胞为主,胎牛血清浓度5%组间充质干细胞的纯度较10%及20%组高,破骨样细胞相对较少;胎牛血清包被组与未包被组相比,贴壁细胞少,培养的间充质干细胞纯度较高,破骨样细胞相对较少。②流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,脐血P3代间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD45、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论:将脐血单个核细胞以1×1011L-1高密度接种在5%低胎牛血清浓度的低糖DMEM培养基中、胎牛血清包被培养瓶等条件下,可以在体外成功的培养出较纯化的脐血间充质干细胞,其培养成功率和间充质干细胞纯度较高。     

人脐带间充质干细胞分离培养鉴定及诱导分化实验

目的 建立人脐带间充质干细胞(MSCs)分离培养方法,并进行生物学鉴定及定向诱导分化研究。方法 采用酶消化Wharton胶法体外分离培养人脐带干细胞,通过流式细胞仪分析其表面标记分子,并向成骨、成脂方向诱导分化,钙钴法染色检测ALP,茜素红染色检测矿化结节,油红“O”染色检测脂肪滴,进行干细胞的成骨成脂活性鉴定。结果 分离培养的脐带间充质干细胞CD73,CD90和CD105均表达阳性,阳性率为92.45%,95.45%和96.45%,CD34表达阴性,阳性率仅为1.07%。成骨诱导3周后ALP染色胞质内可见黑色颗粒,4周后可见大量矿化结节。成脂诱导2周后细胞内出现大量脂肪小滴,多数细胞形态变圆,油红“O”染色阳性。结论 脐带来源的间充质干细胞具有成骨、成脂多向分化潜能,为临床干细胞治疗研究的种子细胞来源奠定了基础。     

右美托咪定对脐血间充质干细胞向神经细胞分化的影响

背景：大量研究证实右美托咪定在缺血再灌注损伤中具有显著的神经保护作用,但是其对神经系统的作用机制以及影响神经细胞功能的途径和方式鲜见报道。目的：探讨右美托咪定对脐血间充质干细胞增殖及向神经细胞分化的影响。方法：取第3代脐血间充质干细胞分为对照组、低浓度右美托咪定组（1μg/L）和高浓度右美托咪定组（10μg/L）,MTT法检测脐血间充质干细胞活性,Western blot法检测增殖期脐血间充质干细胞中ERK1/2磷酸化水平,免疫荧光法检测Neu N/DAPI、GFAP/DAPI和Nestin/DAPI双染细胞比例,观察细胞分化能力。结果与结论：低浓度右美托咪定组干细胞活性及EKR1/2磷酸化水平较对照组明显增加（P〈0.05）;高浓度右美托咪定组干细胞活性及EKR1/2磷酸化水平较对照组及低浓度右美托咪定组明显降低（P〈0.05）;高、低浓度右美托咪定组中Neu N、GFAP阳性细胞数较对照组明显增加（P〈0.05）,而Nestin阳性细胞则显著降低（P〈0.05）。结果表明低浓度右美托咪定诱导脐血间充质干细胞增殖而高浓度右美托咪则抑制其增殖,其机制可能通过调节EKR1/2磷酸化而实现的;高、低浓度右美托咪定均诱导脐血间充质干细胞向神经细胞的分化。     

人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进

背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能,以及取材方便等优点而日益受到关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法,并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带,利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,即将传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养,取第3代脐带间充质干细胞进行生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出,第10天左右可形成明显的细胞克隆。将组织块转移到新培养瓶中继续培养,2d后即可见有细胞爬出,细胞生长速度较快,5d即可形成细胞克隆。传代后的细胞形态均一,呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。细胞增殖能力旺盛,平均倍增时间为50 h左右,41.24%的细胞处于G2/S期。体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性,而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。     

人脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞移植用于大鼠脊髓损伤的实验研究

目的:探讨人脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞(MSCs)移植对脊髓损伤功能恢复的影响,寻找一种更适合治疗脊髓损伤的细胞源。方法:采集新鲜人脐带血和脐带,分离培养单个核细胞和MSCs。将脊髓损伤模型随机分成3组:单个核细胞移植组、MSCs移植组和低糖必需培养基(L-DMEM)培养组。采用免疫组化和免疫荧光检测细胞移植后1—4周细胞在脊髓内的存活情况和迁移情况,使用BBB行为学评分评估大鼠脊髓功能恢复情况。结果:L-DMEM培养液组在术后各时间点观察评分无明显差异,而细胞移植组脊髓功能处于逐渐恢复过程,与L-DMEM培养液比较,差异有显著性意义。单个核细胞移植组对损伤脊髓功能的修复作用较MSCs移植组显著,且差异有显著性意义。结论:与MSCs相比较,人脐血单个核细胞更适合作为治疗脊髓损伤的细胞源。     

不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异

背景：脐血间充质干细胞为干细胞领域的研究热点,但目前传代及扩增此类细胞尚无简单、有效、完美培养方法.目的：采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质干细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质干细胞的方法.方法：无菌条件下取正常足月剖宫产新生儿的脐血,随机分为5组：低糖DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）组、高糖DMEM组、α-DMEM组、低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组.用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的上述培养基中,放置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化并用流式细胞技术分析细胞的表面抗原.结果与结论：①各组间充质干细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较：低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组的贴壁细胞数明显多于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）,细胞存活率亦明显高于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）.②各组间充质干细胞在不同培养时间下生长状态的比较：培养第3,6,9,12,15,18,21天低糖 DMEM＋干细胞因子组、低糖 DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组细胞增殖的速度均快于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P 〈0.05）.低糖DMEM＋干细胞因子组与低糖DMEM ＋骨髓间充质干细胞培养上清组比较差异无显著性意义.结果可见人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清或干细胞因子共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。     

人脐带间充质干细胞超微结构观察

本研究观察脐带间充质干细胞的超微结构。用胶原酶消化法分离培养足月新生儿的人脐带间充质干细胞(hUCMSC),进行传代培养、扩增,在显微镜下观察其细胞形态。对培养至第3代的hUCMSC进行免疫表型测定,进行成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞诱导分化实验,并在透射电子显微镜、扫描电子显微镜下进行超微结构的观察。结果表明,hUCMSC外观呈梭形和多角形,并可见细胞核;高表达表面标志CD44,CD73,CD105,不表达CD34,CD45,CD31和HLA-DR;能够进行成脂、成骨、成软骨分化。在扫描电子显微镜下可见细胞表面有短而粗的微绒毛突起,在透射电子显微镜下可见到两种不同的细胞形态:一种处于静止期,细胞核大,圆或卵圆形,仅有1个核仁,胞质内细胞器少;另一种处于相对活跃期,同一个细胞内可以看到1个或2个细胞核,细胞器数量丰富、结构清晰,并可见扩张的线粒体。结论:从脐带中分离培养的细胞具有间充质干细胞的生物学特性,具有两种不同状态的超微结构。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

人脐血间充质干细胞体外向神经元样细胞分化的实验研究

目的:探讨来源于人脐带血的间充质干细胞体外诱导分化成神经元样细胞的可行性。方法:采用密度梯度离心方法分离人脐带血单个核细胞,用MesenCult培养液体外扩增生长传代培养,于倒置显微镜下观察其生长特性。取第3代的脐血间充质干细胞,用10μg／L成纤维细胞生长因子和30μmol／L全反式维甲酸诱导培养的细胞向神经细胞分化。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于诱导前、诱导后5 d和10 d分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色。结果:培养3代的脐血间充质干细胞经全反式维甲酸和成纤维细胞生长因子诱导后发生形态改变,呈双极或多极的神经元样形态,诱导5 d时神经元特异性烯醇化酶表达率为(30.3±5.2)％,而诱导10 d时达到(53．9±6.5)％,二者差异有统计学意义(P<0．05),不表达胶质纤维酸性蛋白。结论:脐血间充质干细胞经成纤维细胞生长因子和全反式维甲酸体外诱导,能够分化为神经元样细胞。     

脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞,在临床应用中存在一定的风险。目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血,收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞,分为两组,分别以DMEM/F12为基础培养基,添加胎牛血清或混合脐血血浆,经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中,分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液,对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上,观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长,间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异,均具有成骨、成脂分化的能力,但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁,且具有向成骨细胞分化的能力,采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明,脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存,并维持了间充质干细胞的基本生物学特性,是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。     

脐血间充质干细胞的造血支持

背景：脐血造血干细胞移植价值日益突出,造血干细胞体外扩增已成为干细胞领域的研究热点。目的：复习相关文献,对脐血间充质干细胞支持造血作用研究现状与应用前景进行综述。方法：应用计算机检索CNKI和PubMed数据库中2001至2012年关于脐血间充质干细胞造血支持作用的文章,中文检索词为＂脐血间充质干细胞,造血干细胞,CD34＋细胞,体外扩增＂,英文检索词为＂Hematopoietic stem cell expansion,CD34＋cell expansion,Umbilical cord blood mesenchymal stem cells＂。最终选择35篇文章进入结果分析。结果与结论：脐血间充质干细胞支持造血作用的多种作用机制,包括分泌多种具有造血支持作用的细胞因子,表达与造血细胞相互作用的黏附分子等。因此,体外扩增造血干细胞,临床联合移植间充质干细胞和造血干细胞,提高造血重建的能力,具有广阔的研究前景。