豚鼠早期实验性近视眼巩膜成纤维细胞前部及后极部MMP-2 mRNA及蛋白表达变化的研究

目的研究豚鼠早期实验性近视眼巩膜成纤维细胞(guineapig scleral fibroblast,GSF)前部及后极部基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)的改变,探索近视的发病机制。方法 2周龄豚鼠30只作为实验组,另外再随机选取5只(10眼)正常2周龄豚鼠不作任何干预,作为正常对照眼。选取任意眼戴-10.00DS凹透镜,分别饲养6d、15d、30d后除去镜片,验光及测眼轴长度确定近视形成后,采用组织块培养法培养豚鼠的前部及后极部GSF,利用免疫细胞化学、实时荧光定量PCR、Western blot蛋白印迹法检测前部及后极部GSF中MMP-2表达变化。结果 MMP-2的表达定位于细胞浆和细胞核。实验组中前部GSF饲养15d阳性表达率较高,30d阳性表达率最高;后极部GSF饲养6d表达率开始较高,至15d阳性表达率最高,以后保持较高的阳性表达率,各诱导时间点之间两两比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);自身对照组各组自身前部及后极部比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论体外培养的豚鼠GSF稳定表达MMP-2 mRNA及其蛋白,且前部GSF于诱导15d开始阳性表达率较高,后极部GSF于诱导6d开始阳性表达率较高,后极部GSF较前部表达明显增多。     

体内实验观察bFGF对视网膜色素上皮细胞再生的促进作用

目的：观察重组人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF)在体内对兔视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium RPE) 细胞再生的作用。方法：应用氩绿激光照射，造成兔RPE损伤模型，照射后应用bFGF3000U/50uL玻璃体腔内注射，眼底荧光素血管造影检查，测定照射后1－4d透见荧光面积和荧光素渗漏面积，并与对照眼进行比较。结果：照射后第1天和第2天，2组眼的透见荧光面积和荧光素渗漏面积无显著差异（P＝0．534，0．283），第3天和第4天，2组眼的透见荧光面积和荧光素渗漏面积有显著差异（P＝0．0180，0．0007）。结论：体内外源性bFGF能促进RPE的再生和修复，bFGF不具有种属特异性。     

Rac1在缺氧条件下培养的人视网膜色素上皮细胞的表达

目的观察Rac1在缺氧条件下培养的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞的表达,以探讨其在脉络膜新生血管形成中可能的作用。方法将人RPE细胞在含有200μmol·L^-1CoCl2的培养液内分别培养0.5h、1h、2h、4h、8h、12h和24h。运用免疫细胞化学方法及Western-blot技术检测缺氧条件下RPE细胞Rac1的表达及时相变化。常氧状态下培养的RPE细胞作为对照。结果缺氧条件下RPE细胞早期即有Rac1的表达,主要位于胞浆,随着缺氧时间的延长,阳性表达量上调,在8h达到高峰,12h开始下降。与常氧组对照,差异有统计学意义（P〈0.05）。Western-blot分析结果与免疫细胞化学染色结果一致。结论Rac1在缺氧早期的RPE细胞中呈瞬时高表达,可能与脉络膜新生血管形成有关。     

bFGF对实验性近视眼巩膜成纤维细胞增殖的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对豚鼠镜片诱导型近视眼(1ens-in duced myopia,LIM)后极部巩膜成纤维细胞增殖程度的影响,从而探讨bFGF在近视眼的发病机制中的作用.方法 2周龄豚鼠10只随机选取一眼用镜片诱导方法制备动物近视模型(实验眼,LIM),对侧为自身对照(对照眼,SC).造模45 d,实验前后均检测每只豚鼠双眼屈光状态、眼轴长度.用组织块培养法培养豚鼠后极部巩膜成纤维细胞,并传2代.用免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定.将每只眼培养的细胞分为空白组(A组)、1 ng·mL-1bFGF组(B组)、10 ng·mL-1bFGF组(C组)、100 ng·mL-1bFGF组(D组),利用MTT法检测各组细胞增殖的程度.结果 镜片诱导前豚鼠双眼屈光度无明显差异,经过45 d镜片诱导,实验眼形成明显近视,实验眼与对照眼比较,诱导出(-6.70±1.93)D的相对近视,眼轴相对延长了(1.53±0.31)mm,实验前后变化差异有统计学意义(P＜0.05).所培养细胞经免疫细胞化学鉴定为成纤维细胞.实验组中B组与A组之间细胞增殖差异无统计学意义,C组、D组和A组之间差异有统计学意义,C组、D组细胞数量分别增长24.9%、14.2%;对照组中B组与A组之间细胞增殖差异无统计学意义,C组、D组和A组之间差异有统计学意义,C组、D组细胞数量分别增长27.4%、12.5%.结论 凹透镜诱导可引起豚鼠明显轴性近视.bFGF可以有效促进豚鼠巩膜成纤维细胞的增长,其中10 ng·mL-1的促增长作用最强,但对实验眼和对照眼来说,其促增长作用无明显差异.     

应用转基因技术体外培养表达人碱性成纤维细胞生长因子的视网膜色素上皮细胞

目的 探讨应用转基因技术体外培养稳定表达人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的可行性。方法 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为标记基因的人bFGF真核表达载体pcFG。应用脂质体介导法转染人RPE细胞,以G418筛选出表达bFGF的RPE细胞,并进行细胞克隆,传代培养4周。于荧光显微镜下观察GFP的表达情况,用原位杂交和免疫组织化学染色法检测bFGF在RPE细胞的表达情况。结果 酶切结果证实含有GFP的真核表达载体pcFG构建正确。在荧光显微镜下可见RPE细胞表达绿色荧光蛋白。经原位杂交和免疫组织化学染色证实,转染pcFG后的RPE细胞内有大量bFGF—mRNA的转录蛋白表达。结论 应用转基因技术可体外培养稳定表达bFGF的RPE细胞。     

豚鼠早期实验性近视眼RPE细胞的培养及生长周期的变化

目的研究豚鼠早期实验性近视眼视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞原代培养方法及生长周期的改变,探索近视的发病机制。方法 2周龄豚鼠30只随机分为A、B、C组,每组10只,另随机选取5只(10眼)正常2周龄豚鼠不做任何干预,作为正常对照眼。选取任意眼戴-10.00DS凹透镜,A、B、C3组分别饲养6d、15d、30d后除去镜片,验光及测眼轴长度确定近视形成后,采用细胞酶消化法培养豚鼠的前部及后部RPE细胞,取第3-6代RPE细胞检查细胞生长周期。结果前部RPE细胞于诱导15d后发现G0-G1期细胞百分比升高,S期细胞百分比降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);30d时G0-G1期细胞百分比又降低,S期升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。后极部RPE细胞分别于诱导6d、15d后出现G0-G1期细胞百分比明显升高,S期细胞百分比明显降低,与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 RPE细胞的形态、生长周期及细胞因子等都在近视眼发生发展过程中起作用。     

Bcl-2及bFGF在维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡中的表达

目的探讨维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡作用,观察凋亡过程中原癌基因蛋白质(Bcl2)和碱性成纤维细胞生长因子(baic fibroblast growth factor,bFGF)的表达变化。方法应用80mg·L-1Ver作用于体外培养的人RPE细胞12h、24h、48h,吖啶橙(acridineorange,AO)荧光染色及透射电镜观察RPE细胞凋亡;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Bcl2mRNA和bFGFmRNA表达变化。结果经Ver作用的体外培养的人RPE细胞具有典型的凋亡形态学特征:核染色质浓染、边集;细胞体积缩小。同时RPE细胞Bcl2mRNA表达下降;而bFGFmRNA表达随着作用时间延长,呈增高趋势。结论Ver可诱导体外培养人RPE细胞凋亡,凋亡过程中Bcl2表达逐渐下降,而bFGF表达增强。     

舒拉明对碱性成纤维细胞生长因子促进人视网膜色素上皮细胞增殖作用拮抗效应的研究

目的探讨舒拉明抗增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的作用及机制。方法采用体外培养的人眼视网膜色素上皮(RPE)细胞,总共10组。其中5个对照组的培养基中分别加入终浓度为1、10、100、500ng/ml的bFGF和3125μg/ml的舒拉明。实验组4组,培养基中除加入3125μg/ml的舒拉明外,还分别加入终浓度为1、10、100和500ng/ml的bFGF。另设1组空白组。培养48h后,采用MTT法,酶联免疫检测仪测定各孔吸光度(A)值,计算细胞的增殖率。采用析因分析比较bFGF和舒拉明的交互效应和单独效应。结果各组细胞生长无明显的形态学差异。舒拉明与bFGF存在拮抗性交互效应(F=673,P<001)。对照组比较空白组,全部bFGF组A值都增加,最大A值为bFGF的10ng/ml浓度组;舒拉明组则降低;实验组中,各组A值较bFGF对照组都下降,最大A值左移对应bFGF的100ng/ml浓度组。结论舒拉明能够拮抗bFGF促RPE细胞增殖的作用,其抑制RPE细胞增殖并进一步防治PVR的机制至少包括拮抗了生长因子的生物学效应。     

不同光照形式对豚鼠视网膜色素上皮细胞TGF-β2表达的影响

目的：探讨不同光照形式对豚鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达转化生长因子-β₂(transforming growth factor β₂,TGF-β₂)的影响。

方法：幼年健康豚鼠(2周龄)10只,体外培养RPE细胞,传代、鉴定后,将细胞分为聚焦光组、离焦光组、平行光组和空白对照组,前3组分别接受聚焦光、离焦光(均为将平行光经透镜转化)和平行光照射,空白对照组不接受照射。于照射后24h采用免疫细胞化学法、实时荧光定量PCR法(real-time fluorescence quantitative PCR, RTFQ-PCR)检测细胞中TGF-β₂及TGF-β₂ mRNA的表达,分析不同光照形式与效应的关系。

结果：免疫细胞化学法显示各组TGF-β₂表达均为阳性,病理VISTA图像分析软件测量单位面积中平均光密度(optical density,OD)值进行半定量分析,聚焦光组明显高于其它各组,组间比较有统计学差异(F=11.08,P<0.05); RTFQ-PCR法显示,聚焦光组TGF-β₂mRNA表达水平较其它各组明显增加,组间比较有统计学差异(F=133.01,P<0.05)。

结论：不同形式光线可影响豚鼠RPE细胞TGF-β₂表达,以聚焦光最明显。     

bFGF对人晶状体上皮细胞中FAK表达的影响

目的:观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)引起体外培养的人晶状体上皮细胞迁移和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)mRNA水平的动态变化.方法:体外培养的第3代人晶状体上皮细胞,建立细胞划痕损伤模型,经0,5,10,15μg/L bFGF作用8～16h后,电脑图像法测定细胞迁移距离,RT-PCR法检测0,1,4,8,16h FAK mRNA水平,免疫荧光法检测整合素β1和增殖细胞核抗原表达阳性率的变化.结果:与对照组比,5μg/L 组细胞迁移距离和FAK mRNA表达显著增加(P＜0.05):10μg/L 组细胞整合素β1表达阳性率显著增加(P＜0.05);15μg/L 细胞迁移距离和FAKmRNA显著降低(P＜0.05).结论:bFGF引起人晶状体上皮细胞迁移距离和FAK mRNA表达的变化.     

豚鼠透镜诱导型近视视网膜色素上皮细胞钙离子的研究

目的激光扫描共焦显微镜（LSCM）检测豚鼠透镜诱导型近视模型视网膜色素上皮（RPE）细胞中Ca2＋,探讨Ca2＋在近视发病中的作用机制。方法取2周龄豚鼠10只,选取1只眼用-10.00D凹透镜诱导成近视模型为实验眼,对侧眼为对照眼。实验前后测各组豚鼠屈光度及眼轴长度（AL）。原代培养豚鼠眼球赤道前部及后极部RPE细胞,用角蛋白、波形蛋白、结蛋白、S-100抗体进行免疫细胞化学检测对培养细胞进行鉴定。对各组豚鼠眼赤道前部及后极部RPE细胞进行Fluo-3/AM负载,利用LSCM测定细胞中Ca2＋的变化。结果豚鼠经过45d的透镜诱导,形成（-6.70±1.93）D的相对近视,AL延长了（1.53±0.31）mm,与诱导前的屈光度和AL相比,差异均有统计学意义（F=10.97,P〈0.05;F=-15.64,P〈0.05）。实验眼前部和后极部RPE细胞Ca2＋的荧光强度明显高于对照眼,差异有统计学意义（P〈0.05）,而实验眼和对照眼各自前部和后极部的RPE细胞Ca2＋的荧光强度比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论在实验性近视形成过程中,RPE细胞中Ca2＋浓度增高。     

透镜诱导型近视眼视网膜色素上皮细胞肝细胞生长因子表达的变化

目的观察豚鼠镜片诱导型近视眼（LIM）眼球前部及后极部视网膜色素上皮（RPE）细胞中肝细胞生长因子（HGF）的表达变化,探讨近视眼的发病机制。方法取2周龄豚鼠10只,随机选择一眼作为实验眼,制备近视眼模型（眼前配戴凹透镜45d）,对侧眼作为自身对照。实验前后测量豚鼠双眼屈光度和眼轴长度。原代培养豚鼠视网膜前部及后极部RPE细胞,传1代后,对各组RPE细胞HGF表达进行免疫细胞化学分析。采用SPSS12．0统计软件对相关数据进行配对t检验和单因素方差分析。结果①豚鼠经过45d的透镜诱导后,形成（-6．70±1．93）D的相对近视,眼轴延长（1．53±0．31）mm,前后差异有统计学意义（t=-9．25,t=9．17,P〈0．05）,近视模型造模成功。②在光镜下观察免疫细胞化学爬片显示．HGF存RPE细胞中的表达定位于细胞浆,细胞核无着色。近视眼前部和后极部RPE细胞的HGF表达明最高于自身对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;近视模型眼和对照眼自身前部与后极部HGF表达比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论体外培养的豚鼠RPE细胞稳定表达HGF：HGF在近视模型眼前部和后极部RPE细胞中的活性都升高,参与了实验性近视眼的形成。     

视网膜下液对培养的人眼视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞增殖作用的影响

目的：了解不同程度增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的视网膜下液（SRF）对视网膜色素上皮细胞（RPE）、成纤维细胞（FB）增殖的影响。方法：用溴标法和MTT法测定不同程度PVR的SRF对RPE和FB增殖的促进作用。结果：几乎所有的SRF都具有促进细胞增殖的作用,用1：10比例稀释,PVR程度为PVR＜C1,PVRC1,PVR＞C13组。SRF作用24h后RPE的增殖率分别为对照组的128.5％,139.8％,156.8％,FB的增殖率分别为对照组的126.3％,143.1％及172.3％。结论：SRF液促进细胞增殖的作用随着PVR程度的加重而增强。     

视网膜色素上皮细胞在增生性玻璃体视网膜病变中的作用

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是在炎症和免疫功能细胞及多种活化因子对眼内细胞修复反应的调控过程中,由于过度促进细胞增殖、移行以及由细胞介导的胶原收缩而形成的。参与PVR的细胞目前已知的有5种,其中视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞是最主要的,本文将影响RPE细胞功能的各种影响因素及PVR的治疗进展作一综述。     

bFGF在体外培养的正常人及白内障患者LECs中的表达

目的 体外培养正常人及白内障患者晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs),分别检测碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)在体外培养的正常人及白内障患者LECs中的表达,以探讨bFGF在白内障患者LECs中的作用.方法 体外培养正常人及白内障患者LECs并传代;利用免疫组织化学法和免疫印迹法,检测bFGF在体外培养的正常人及白内障患者LECs不同阶段的蛋白水平的表达.结果 原代培养的正常人及白内障患者LECs无明显差异,但在传代过程中白内障患者的LECs出现了较早的细胞衰老现象;在正常人原代培养细胞和传代的LECs中检测不到bFGF的表达,或仅有微弱表达,而在白内障患者的原代培养细胞和传代的LECs中,bFGF的表达较正常人明显增多,并明确表达了相对分子质量为17 000的蛋白.结论 老年性白内障LECs相对正常LECs而言,生长缓慢,容易出现细胞衰老现象,且有丝分裂能力差;白内障患者术后残留的LECs引起损伤修复过程,合成并释放bFGF,造成LECs的增生、移行和纤维化,并可能成为后囊混浊的原因之一.     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞增生和VEGF表达的影响

目的　观察缺氧对培养的人视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelial,RPE)细胞增生和血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达的影响。 方法将培养的人RPE细胞接种于 2 4孔板 ,分别放入正常和缺氧环境中培养 ,于 1、2、3、4、5d后用四甲基偶氮唑蓝 [3 ( 4 ,5 dimethylthiazole 2yl) 2 ,5 diphenyltetrazoliumbromide ,MTT]比色法检测RPE细胞的增生 ,于 6、12、2 4h后用免疫组织化学法检测RPE细胞对VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析。结果　缺氧组的MTT实验吸光度 (A值 )均高于正常组 (P <0 .0 1) ;抗VEGF抗体染色 ,缺氧组明显强于正常组 (P <0 .0 5 )。结论缺氧可促进RPE细胞的增生及其对VEGF的表达 ,控制RPE细胞的活动是抑制脉络膜新生血管生成的关键     

玻璃膜疣主要成分胆固醇对人视网膜色素上皮细胞金属硫蛋白表达的影响

目的:研究玻璃膜疣主要成分胆固醇对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中金属硫蛋白表达的影响.方法:体外培养ARPE-19细胞,将细胞分为对照组和胆固醇处理组(2.5 mg/mL),取样时间为0,6,12,24,48,72 h.通过实时定量PCR检测hMT1a,hMT2a和hMT3在转录水平的表达,用蛋白质印迹法检测总金...     

Construction of a cDNA library from human retinal pigment epithelial cells challenged with rod outer segments

Background: To study genes expressed by retinal pigment epithelial (RPE) cells during phagocytosis and digestion of rod outer segments (ROS), a complementary (c)DNA library was produced using an in-vitro model. The cDNA library can be used to study molecular changes which contribute to the development of diseases due to a failure in outer segment phagocytosis and digestion by RPE cells. Here we demonstrate a way to study genes and their functions using a molecular biological approach and describing the first step involved in this process, the construction of a cDNA library.
Methods and results: Human RPE cells obtained from the eyes of a seven-year-old donor were cultured and challenged with bovine ROS. The culture was harvested and total RNA was extracted. Complementary DNA was transcribed from the messenger (m)RNA and was directionally cloned into the LambdaGEM-4 bacteriophage vector successfully. Some clones were picked and the DNA extracted, to determine the size of the inserts as a measure of the quality of the library.
Conclusions: Molecular biology and cell culture are important tools to be used in eye research, especially in areas where tissue is limiting and animal models are not available. We now have a ROS challenged RPE cDNA library which will be used to identify genes responsible for degrading phagocytosed debris within the retinal pigment epithelium.