神经干细胞定向迁移机制研究新进展

二十世纪九十年代初期，研究者从成年哺乳动物脑组织内分离出能够不断分裂增殖，具有多分化潜能的细胞群落，提出了神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的概念。近年来的研究发现，在哺乳动物胚胎发育过程或病理情况下NSCs存在有序的定向迁移过程。NSCs的定向迁移不仅对机体发育具有至关重要的作用，对于中枢神经系统损伤的修复也具有重大意义。在迁移过程中NSCs是如何循着一定的路线，确定路标，顺利到达目的地一直是人们感兴趣的问题。本文就近年来在NSCs定向迁移机制研究中取得的一些进展做一综述。     

脑卒中病人血浆纤维连接蛋白测定的临床意义

纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn)是一种多功能蛋白质,具有多种生物学功能。有研究认为Fn参与了血小板的聚集与粘附,它的减少或缺乏是微循环紊乱因素之一。为此我们观察了脑卒中患者血浆Fn的变化,现报告如下。     

EGF对神经干细胞迁移的影响

目的研究表皮生长因子(EGF)对神经干细胞迁移的影响。方法取孕13—14dSD大鼠胚胎纹状体行神经干细胞培养，7d后取悬浮神经球制成单细胞悬液再培养，EGF作用下连续培养14d后分为实验组和对照组，继续培养，观察：EGF对神经干细胞迁移的影响。结果原代培养的细胞球是神经干细胞，EGF传代培养14d时细胞球大小约100个细胞左右，实验组观察到第14d细胞球增殖变慢，细胞球长出突起与邻近的细胞球相接触，14—17d观察到神经干细胞迁移，17d后细胞迁移现象消失；对照组中未观察到细胞迁移。结论：EGF在某一特定时间内能够诱导神经干细胞迁移。     

神经干细胞发育过程中分化、迁移调控机制研究现状

有关神经干细胞的研究已成热点。神经干细胞的分化，迁移受内因（基因调控）和外因（细胞周围环境）等因素的影响。体外模型的建立，可以将很多因素进行量化或单一化。并进行生理环境的模拟控制。为神经干细胞生物学特性的研究提供了很好的手段。本就神经干细胞发育过程中分化，迁移调控机制的研究现状作一综述。     

神经胶质瘤诱导骨髓基质干细胞定向迁移的初步研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对神经胶质瘤的定向迁移能力及其在脑内的分布规律. 方法 从雄性Wistar大鼠股骨和胫骨中分离出BMSCs并进行传代培养,采用免疫荧光检测BMSCs表面抗原并将其向脂肪细胞和成骨细胞方向诱导分化.证明BMSCs性质.立体定向接种C6胶质瘤细胞于Wistar大鼠脑内基底节区以建立鼠腩胶质瘤模型,7 d后将5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记的BMSCs接种入鼠脑对侧半球、对侧脑室和鼠尾静脉.BMSCS移植14d后心脏灌注取脑制成石蜡切片.以HE染色确定胶质瘤性质.SABC法免疫荧光染色显示BMSCs对神经胶质瘤组织的定向迁移能力及其在脑内的分布规律. 结果 对侧半球组和对侧脑室组均可见移植的BMSCs多沿针道直线分布并向对侧胶质瘤迁移.在胶质瘤与正常脑组织交界处可见激发出绿色荧光的阳性BMSCs:鼠尾静脉组亦可见少量BMSCs阳性细胞分布在胶质瘤组织周围. 结论 BMSCs通过脑实质、脑室及静脉注射途径均可定向迁移到胶质瘤组织,提示BMSCs可作为一种新的细胞载体用于胶质瘤的基因治疗.     

Wnt-1在大鼠喙侧神经干细胞迁移流中的时空表达

目的比较在大鼠脑发育过程中,Wnt-1在喙侧神经干细胞迁移流中表达水平的时空差异.方法以5-溴脱氧尿嘧啶尿苷(BrdU)对胚胎14 d、出生后0 d和7 d的Wistar大鼠行活体标记,取各时相点鼠脑,冰冻切片,行BrdU、Wnt-1和胶质纤维酸性蛋白( GFAP)免疫荧光染色,比较在上述三个时相点,Wnt-1于室管膜前下区、迁移流主干部分和嗅球三个部位的表达情况.结果在时间上,Wnt-1的表达在胚胎14 d高于出生后0 d和7 d,出生后0 d和7 d的表达情况相似;在空间上,Wnt-1的表达在嗅球最高,室管膜前下区稍低,在神经干细胞迁移流主干部分的表达最低.结论随着大鼠脑的发育,Wnt-1于喙侧神经干细胞迁移流中的表达逐渐减弱;在胚胎期及出生后早期,Wnt-1在喙侧神经干细胞迁移流中表达的空间分布情况相似.     

神经干细胞的迁移和网络化

神经干细胞的迁移和网络化是近一个世纪以来神经科学领域研究的热点之一。目前已经有比较成熟的理论解释神经系统生长发育过程中神经干细胞的迁移和网络化复杂的机制，在近年来兴起的神经干细胞移植技术中也得到进一步的证实和应用。本文将分别从神经干细胞的迁移现象及其定向迁移的可能机制．神经网络的研究进展和神经干细胞迁移和网络化的意义等方面进行综述．     

TRPC1沉默对脑缺血大鼠神经干细胞迁移的影响

目的探讨瞬时受体电位通道1(TRPC1)沉默对脑缺血大鼠内源性神经干细胞增殖、迁移和分化的影响。方法 SD大鼠分为假手术组、脑缺血组、TRPC1沉默组(脑缺血+TRPC1沉默)和阴性对照组,以脑室内注射siRNA沉默TRPC1,以线栓法制作大鼠大脑中动脉脑缺血(MCAO)模型,脑缺血模型制作成功后,腹腔内注射Brdu标记内源性神经干细胞,分别于48 h、4 w后处死大鼠,行Brdu免疫组化染色、免疫荧光双标染色(Brdu/GFAP、Brdu/Neun)观察NSC的增殖、迁移和分化情况。结果脑缺血后48 h,脑缺血组和TRPC1沉默组SVZ区Brdu阳性表达均较假手术组明显增多(P0.01),但TRPC1沉默组Brdu阳性细胞数较缺血组低(P0.01)。脑缺血4 w后,缺血组与假手术组相比,皮质区具有更多的Brdu阳性细胞(P0.01),同样TRPC1沉默组Brdu阳性细胞数多于假手术组,但明显低于脑缺血组(P0.01);免疫荧光双标染色发现,脑缺血各组Brdu/GFAP、Brdu/Neun双阳性细胞的数量均比假手术组明显增高,但TRPC沉默组双阳性细胞显著少于脑缺血组和阴性对照组(P0.01)。结论 TRPC1沉默显著影响脑缺血大鼠SVZ区NSC的增殖、向脑缺血区迁移及向成熟细胞的分化。     

人胎脑神经干细胞在发育期脑脊液中的迁移和分化

目的：探讨人发育期脑脊液对胎脑神经干细胞迁移和分化行为的影响。 方法：取实验室液氮冻存的孕龄16周的胎脑细胞,复苏后加入含EGF、bFGF、B27及N2的DMEM/F12培养基,14 d后获得生长状况良好的神经球。胚胎组先后从蛛网膜下腔和脑室吸出脑脊液,小儿组均由腰椎穿刺或脑室穿刺获得脑脊液,将培养14 d的神经球分别接种于两组脑脊液中,于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中培养。观察神经球在脑脊液中的迁移和生长状态,免疫荧光鉴定脑脊液对神经细胞分化的影响。 结果：神经球接种到脑脊液后,除小儿组有少数几个神经球未发生迁移外,其余神经球均在培养6 h即向外周迁移,且神经球周边细胞向外发出突起,形成细胞索,细胞索向外周延伸后进一步编织成细胞网。与胚胎组比较,小儿组胶质纤维酸性蛋白阳性率明显升高(P < 0.01),神经纤维及巢蛋白阳性率均明显降低(P < 0.01)。此外,仅小儿组3份脑脊液培养的细胞为半乳糖脑苷脂阳性。 结论：不同发育时期的脑脊液对神经干细胞的迁移和分化作用效果各异,提示脑脊液参与神经发育的调控,是脑发育的重要微环境影响因素。     

干细胞对脑胶质瘤定向迁移的研究进展

基因疗法是治疗胶质瘤最有希望的疗法之一,但递送问题一直妨碍着新基因治疗策略的发展.干细胞因具有增殖及向胶质瘤迁移的性质,尤其适合作为基因治疗的递送载体细胞,干细胞的"病灶定向迁移一增殖"特性组合,展现出干细胞在替代治疗之外的又一诱人应用前景.至今为止,已经就神经干细胞、骨髓基质干细胞以及来源于胚胎干细胞的分化细胞等对脑胶质瘤的定向迁移进行了广泛的研究.干细胞定向迁移、追踪侵润肿瘤细胞的机制与趋化因子介导有关.     

体外培养人类神经干细胞神经球中髓鞘的形成

目的：探索人类神经干细胞的体外培养条件和其形成的神经球的超微结构。方法：从胎脑皮质中机械分离细胞，N2培养基培养和扩增人类神经干细胞，应用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。对形成的神经球应用透射电镜进行超微结构研究。结果：从胎儿的脑皮质中成功分离培养出神经干细胞，形成典型的神经球，大部分细胞表达神经干细胞的标志物波形蛋白，细胞贴壁后可诱导分化 为神经元和胶质。早期培养的神经球中有典型的髓鞘形成。结论：从胎儿的脑皮质中成功地分离、培养出人类的神经干细胞，细胞呈悬浮状态生长，形成神经球。这种早期培养的神经干细胞有形成髓鞘的能力，可作为治疗人类脱髓鞘病变的潜在细胞来源。     

Ultrastructure of human neural stem/progenitor cells and neurospheres

BACKGROUND: Biological and morphological characteristics of neural stern/progenitor cells (NSPCs) have been widely investigated.OBJECTIVE: To explore the ultrastructure of human embryo-derived NSPCs and neurospheres cultivated in vitro using electron microscopy.DESIGN, TIME AND SETTING: A cell biology experiment was performed at the Brain Tumor Laboratory of Soochow University, and Jiangsu Province Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University between August 2007 and April 2008.MATERIALS: Human fetal brain tissue was obtained from an 8-week-old aborted fetus; serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium/F12 culture medium was provided by Gibco, USA; scanning electron microscope was provided by Hitachi instruments, Japan; transmission electron microscope was provided by JEOL, Japan.METHODS: NSPCs were isolated from human fetal brain tissue and cultivated in serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium/F12 culture medium. Cells were passaged every 5-7 days. After three passages, NSPCs were harvested and used for ultrastructural examination.MAIN OUTCOME MEASURES: Ultrastructural examination of human NSPCs and adjacent cells in neurospheres.RESULTS: Individual NSPCs were visible as spherical morphologies with rough surfaces under scanning electron microscope. Generally, they had large nuclei and little cytoplasm. Nuclei were frequently globular with large amounts of euchromatin and a small quantity of heterochromatin, and most NSPCs had only one nucleolus. The Golgi apparatus and endoplasmic reticulum were underdeveloped; however, autophagosomes were clearly visible. The neurospheres were made up of NSPCs and non-fixiform material inside. Between adjacent cells and at the cytoplasmic surface of apposed plasma membranes, there were vesicle-like structures. Some membrane boundaries with high permeabilities were observed between some contiguous NSPCs in neurospheres, possibly attributable to plasmalemmal fusion between adjacent cells.CONCLUSION: A large number of autophagosomes were observed in NSPCs and gap junctions were visible between adjacent NSPCs.     

体外诱导人类胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的 探索一种诱导人类胚胎干细胞（hESCs）向神经干细胞（NSCs）定向分化的简单高效的方法。方法 将hESCs在细菌培养皿中以无血清培养基悬浮培养形成拟胚体，进一步将成熟拟胚体打散、贴壁培养于含有B27和noggin等成分的特定培养基中，诱导其向神经干细胞定向分化。结果 悬浮于细菌培养皿中的hESCs不贴壁，进行性长大，7～10d形成成熟拟胚体；拟胚体在特定培养基中可诱导成高纯度（约96．4％）的nestin阳性细胞（即NSCs），进一步培养，这些细胞可分化成各种成熟的神经细胞。结论 该方法诱导hESCs向NSCs定向分化较文献报道耗时更短、费用低廉且效率更高，为进行细胞移植治疗神经系统相关疾病提供了很好的种子细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及分化为神经干细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,MSCs)体外分化为神经干细胞(neural stemcells,NSCs)的可能性。方法取4～6周SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外培养,通过传代得到纯化的MSCs后换用分化液诱导,通过形态学观察诱导后细胞形态变化,并用免疫荧光检测不同天数细胞nestin的表达率;NSCs分化实验对所诱导的NSC的分化潜能进行检测。结果MSCs诱导后的细胞nestin表达率随天数增加逐渐升高,1周后形成高表达nestin的神经干细胞球形细胞团;在含血清培养基中可自然分化为神经元和神经胶质样细胞。结论MSCs能于体外分化出神经干细胞,且具有进一步的分化能力,骨髓来源的神经干细胞将可能作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗。     

基质细胞衍生因子-1诱导神经干细胞靶向性迁移的实验研究

目的 观察基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对神经干细胞(NSCs)迁移的影响.方法 由胚胎大鼠脑组织获取NSCs并进行传代培养和分化鉴定,使用流式细胞术检测NSCs纯度及SDF-1特异性受体CXCR4的表达情况,之后利用Blind-Well小室体外迁移体系观察不同浓度的SDF-1(0 ng/L、1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL和1000 ng/mL)对NSCs迁移数量的影响,并使用μ-载片观察SDF-1对NSCs迁移距离的影响.结果成功分离培养得到了能够在体外不断分裂增殖、具有多向分化潜能的NSCs,连续传3代后绝大部分细胞nestin表达阳性,nestin和CXCR4的共表达率达到80%左右.细胞趋化实验结果表明,SDF-1对NSCs有较强的趋化作用,随着SDF-1浓度的升高,发生迁移的细胞数量也随之增加,并于SDF-1浓度为500ng/mL时达到最高峰[(256.79±38.27)个细胞/每高倍视野].在μ-载片细胞生长通道两侧的SDF-1浓度梯度(500ng/mL→0ng/mL)作用下,由细胞克隆球迁出的细胞呈不对称分布,通常有更多的迁出细胞分布于趋化因子浓度较高的一侧,且该侧细胞的最大迁移距离也比对侧远.结论 SDF-1与其特异性受体CXCR4相巨作用能够诱导NSCs发生靶向性迁移.     

IL-6促进骨髓源性神经干细胞增殖的实验研究

目的研究白细胞介素6(IL-6)及其受体对体外培养的大鼠骨髓源性神经干细胞增殖的影响及信号转导机制。方法采用密度梯度离心法分离骨髓基质细胞,应用特制的神经干细胞培养基诱导培养6d后收集贴壁细胞传代培养,用AlamarBlue摄入法检测不同浓度的IL-6及IL-6受体对大鼠骨髓源性神经干细胞增殖的影响,Westernblot方法检测不同剂量IL-6对干细胞中STAT3表达的影响。结果IL-6能够促进干细胞的增殖,随着药物剂量的增加,增殖作用明显增加,呈明显剂量依赖性,其中20、100、200ng/mL组均与对照组有显著差异(P<0.01),但2ng/mL与对照组、100ng/mL与200ng/mL组之间无显著差异(P>0.05),20ng/mL与100ng/mL组之间有差异(P<0.05)。IL-6受体可抑制干细胞的增殖,单独应用IL-6受体,100ng/mL、200ng/mL组与对照组均有显著差异(P<0.05)。而IL-6与IL-6受体联合应用可促进干细胞的增殖,但增殖作用比单独应用IL-6组差,两组相比有显著性差异(P<0.05)。随IL-6浓度的增加,干细胞中的STAT3表达增加,20、100、200ng/mL组与对照组相差显著(P<0.01)。结论100ng/mL组的IL-6对骨髓源性神经干细胞有较好的增殖促进作用;IL-6受体可抑制骨髓源性神经干细胞增殖;联合应用IL-6和IL-6受体增殖效果不如单独应用IL-6,提示骨髓源性神经干细胞表面自身具有IL-6受体;IL-6通过增加STAT3表达促进骨髓源性神经干细胞增殖。     

成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性研究

目的研究体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性。方法对骨髓源性神经干细胞分别进行细胞形态学观察、刀豆球蛋白A凝集试验和双层软琼脂培养以探明其是否具有恶性转化细胞的形态特征、表面结构及生长特性的变化：利用免疫细胞化学的方法检测骨髓源性神经干细胞的端粒酶和肿瘤相关基因的表达：将骨髓源性神经干细胞接种到裸鼠体内观察其成瘤性。结果骨髓源性神经干细胞不具有恶性转化细胞的形态特征，在不同刀豆球蛋白A浓度下均未见明显的凝集反应，在双层软琼脂不能形成细胞克隆；骨髓源性神经干细胞的c-myc、c-fos和p53基因均呈阴性表达，而端粒酶逆转录酶呈弱阳性表达：将骨髓源性神经干细胞接种于裸鼠皮下6个月未见肿瘤形成，亦未见其它组织形成。结论骨髓源性神经干细胞保持了正常细胞的生物学特征．体内和体外的各项指标均未提示其具有致瘤性．体外的培养条件没有使其发生恶性转化．从致瘤性方面证实了骨髓源性神经干细胞临床移植的安全性。     

PDGF在骨髓问充质干细胞向胶质瘤趋化迁移过程中的作用

目的 观察血小板衍生生长因子(PDGF)和胶质瘤细胞条件培养基对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外迁移能力的影响,探讨PDGF在hMSCs向胶质瘤趋化迁移过程中的作用. 方法 全骨髓贴壁细胞法分离培养hMSCs,应用RT-PCR检测hMSCs中PDGF受体α(PDGFR-α)和β(PDGFR-β)的表达;利用聚碳酸酯膜小室建立体外趋化迁移模型,观察5、50、125 ng/mL PDGF和胶质瘤细胞条件培养基对hMSCs的体外趋化作用以及加入PDGF抗体后对hMSCs趋化迁移的影响. 结果 RT-PCR检测到hMSCs表达PDGFR-α和PDGFR-β;PDGF可以浓度依赖性促进hMSCs的趋化迁移.胶质瘤细胞条件培养基也可趋化hMSCs的迁移.与空白对照组相比迁移细胞数差异均有统计学意义(JP<0.05);PDGF抗体可消除50 ng/mL PDGF、减弱胶质瘤细胞条件培养基对hMSCs趋化迁移的作用. 结论 PDGF促进hMSCs的趋化迁移.在hMSCs向胶质瘤选择性迁移过程中发挥"趋化因子"样作用.     

成年骨髓间质干细胞体外诱导分化成神经细胞研究

目的：探索成年骨髓间质干细胞（ABMMSC）诱导分化为神经细胞（神经元和神经胶质细胞）的可行性，为ABMMSC在神经科学领域内的应用提供 参考。方法：以成年犬ABMMSC为实验对象，利用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（FGF）、维甲酸（RA）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）等作为增殖及分化诱导因子，采用两步法进行增殖培养，分化诱导；免疫细胞化学法进行细胞性质鉴定。结果：加入bFGF、EGF后增殖培养48h，换液、去除非粘附细胞，再增殖培养72h ,可见细胞分裂相（成纤维细胞样细胞）和簇样克隆形成（中小型细胞）。加入RA、BDNF、GDNF诱导3d，部分细胞有神经元特异性烯醇酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）成分表达；第10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成。经细胞成分（NSE、GFAP）鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论：ABMSC在体外培养条件下，经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用，可以向神经元、神经胶质前体细胞及其终末细胞方向分化。     

胶质瘤细胞对神经干细胞增殖影响的初步研究

目的初步探讨几种胶质瘤细胞上清液对神经干细胞增殖的影响。方法取胎鼠全脑原代培养神经干细胞并行免疫荧光鉴定；复苏几种胶质瘤细胞获取上清液；上清液与干细胞培养液混合培养神经干细胞后MTT法作生长曲线并行电镜切片观察。结果原代培养获得神经干细胞；混合培养液培养后的神经干细胞增殖较对照组快，电镜观察可见核质比增高，细胞器发达。结论胶质瘤上清液对神经干细胞的增殖具有一定的促进作用。