米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。     

毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶发酵条件

在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。     

促进米黑根毛霉脂肪酶分泌的毕赤酵母内源信号肽的筛选

米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei Lipase,RML）在造纸、食品、化妆品以及医药等行业应用广泛。本研究通过SignalP 4.1在线预测软件预测出9种具有分泌潜力的毕赤酵母内源信号肽序列：FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9。以广泛应用的酿酒酵母α-交配因子（α-mating factor,α-MF）信号肽为对照,考察这九种内源信号肽对增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）和RML在蛋白酶缺陷型PichiaPinkTM表达系统的分泌效果。结果发现FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介导EGFP分泌,且PRY2、DSE4、MSB2、FRE2介导EGFP的分泌水平优于α-MF,分别是α-MF的2.15倍、1.15倍、1.33倍、1.30倍;FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介导RML的分泌,且FLO10介导RML的分泌水平最高,是α-MF的1.50倍,说明内源信号肽FLO10更能有效分泌RML。本研究为提高米黑根毛霉脂肪酶在蛋白酶缺陷型毕赤酵母的表达量奠定了一定的基础。     

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶（RmMan5A）对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体（RmMan5AM2）。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65 ℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10 ℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10 371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176 000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖（相对峰面积>85%）,总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。     

抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

本研究将来自抗辐射不动杆菌CMC-1的碱性脂肪酶基因去掉信号肽,经密码子优化及全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了重组质粒pPICZαA-ARL,质粒线性化后转化毕赤酵母X33,筛选得到分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X33/pPICZαA-ARL。摇瓶发酵液上清酶活最高达65 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为50℃,最适pH为9.0,最适底物是对硝基苯酚辛酸酯。     

米黑根毛霉α-淀粉酶的定向进化、高效表达及在面包中的应用

本研究利用定向进化技术对米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)来源的α-淀粉酶(RmAmy)进行分子改造,随后对突变酶进行高效表达和在面包中的应用。突变酶(mRmAmy)的最适pH和温度分别为5.0和65℃,比野生型下降1.0 pH和10℃;该酶在pH 4.0～10.0和60℃以下稳定。mRmAmy经高密度发酵168 h,酶活力最高达11 900 U/mL。mRmAmy应用于面包制作中,在加酶量为3 mg/kg时,面包比容增加14.4%,硬度减小25.8%。结果表明mRmAmy在烘焙工业中具有很大的应用潜力。     

雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究

采用同源克隆法获得了雪白根霉的脂肪酶基因(rnl),将其连接到pPICZαA载体上,得到重组表达载体pPICZαA-rnl。将表达载体pPICZαA-rnl用限制性内切酶SacI线性化后,电击转入毕赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中成功表达,重组菌株摇瓶培养144 h后,酶活可达48 U/mL。重组酶最适pH值为8.5,最适反应温度为35℃。1 mmol/L的Mn2+,Ca2+和K+以及1%的表面活性剂吐温20,吐温80,曲通100对重组脂肪酶具有激活作用。重组酶的最适底物为三月桂酸甘油酯(C12)。     

双氧水对米赫根毛霉脂肪酶在米曲霉中重组表达的调控研究

米赫根毛霉脂肪酶RML是具有广泛应用价值的重要微生物脂肪酶。本研究对双氧水调控米曲霉RML转化子ONL1表达脂肪酶进行了研究。荧光定量PCR和SDS-PAGE表明,在转化子培养过程中,维持培养体系中10 mmol/L双氧水2 h,使转化子ONL1的脂肪酶活力提高5倍。在双氧水处理过程中,RML的翻译未受影响,其表达水平的提高源于双氧水对其转录水平的调控。因此,双氧水调控melO启动子控制的外源基因的表达体现在转录水平。由于双氧水易挥发,导致其效果低于延长培养时间。为了在较短培养时间内获得高酶活,应在培养液中持续添加双氧水（10 mmol/L）。基于米曲霉转化子脂肪酶活力的分析和qPCR检测,确定以下策略可用于提高米曲霉中RML的表达水平：脂肪酶RML基因的密码子优化、信号肽序列优化、连续分批培养。     

毕赤酵母分泌表达华根霉脂肪酶（r27RCLC）的糖基化鉴定

研究了毕赤酵母GS115中能够高效分泌表达的华根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化情况。运用糖基化抑制剂衣霉素处理表达目的蛋白的毕赤酵母细胞,通过SDS-PAGE比较分析经衣霉素处理后的脂肪酶r27RCLC分泌表达量的变化,结果显示酶的分泌表达受到很大的抑制,说明脂肪酶r27RCLC在表达时候很可能发生了糖基化,且糖基化对其有重要影响。通过生物化学方法,利用内切糖苷酶PNGase F和Endo Hf酶切处理脂肪酶r27RCLC,SDS-PAGE和Western Blot,结果显示r27RCLC未发生糖基化。将样品r27RCLC通过胰蛋白酶酶解等步骤处理,进行MADLI-TOF-MS质谱分析,结果发现MADLI-TOF-MS鉴定结果与内切糖苷酶酶切处理结果一致,进一步证明毕赤酵母分泌表达的华根霉脂肪酶r27RCLC未发生糖基化。     

固定化米黑根毛霉脂肪酶的制备工艺优化及其酶学性质北大核心CSCD

以海藻酸钠-羧甲基纤维素钠(CMC)为复合载体,戊二醛为交联剂,探究了包埋-交联法制备固定化米黑根毛霉脂肪酶的最佳工艺条件,并对固定化米黑根毛霉脂肪酶的酶学性质进行分析。结果表明,制备固定化米黑根毛霉脂肪酶的最佳工艺条件为海藻酸钠质量分数2.5%、CMC质量分数1.5%、脂肪酶液浓度800 U/mL、CaCl_(2)质量分数5%、戊二醛质量分数0.03%、交联固定化时间30 min,在此条件下固定化米黑根毛霉脂肪酶的酶活力为245.58 U/g,与游离脂肪酶相比,固定化脂肪酶热稳定性和pH稳定性均有所提高。交联剂戊二醛的添加可以提高固定化脂肪酶的操作稳定性和储存稳定性,在重复使用7次后相对酶活力保持在57.39%,在4℃下存放7周后相对酶活力为61.89%。包埋-交联法制备的固定化米黑根毛霉脂肪酶具有更好的稳定性和适应性,为实现植物油酶法酯化脱酸工业化生产提供参考。     

优化密码子及诱导温度提高雪白根霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母密码子的偏好性,通过在线软件对雪白根霉脂肪酶基因(rnl)进行密码子优化。优化后的脂肪酶基因(rnl-opt)GC含量由原来的46%提高到49%,碱基A,T,C,G均匀分布,减少了AT和GC富集区,适应指数由0.82提升到0.85。将rnl-opt连接到表达载体p PICZαA并转入毕赤酵母X33中。将含有rnl和rnlopt的重组工程菌在摇瓶和50 L发酵罐中进行诱导表达。摇瓶培养条件下,含有rnl和rnl-opt重组工程菌的最大酶活分别为458、956 U/m L。50 L发酵罐培养条件下,含有rnl和rnl-opt重组工程菌的最大酶活和总蛋白浓度分别为14 856、30 500 U/m L和3.61、7.8 g/L。为了进一步提高含rnl-opt重组工程菌的表达酶活,对其在50L发酵罐培养的诱导温度进行优化,当诱导温度为22℃时,含rnl-opt重组工程菌的酶活和细胞湿重均达到最大值分别为39 520 U/m L和461 g/L。相对于30℃,酶活和细胞湿重分别提高了30%和16%。     

NH+4离子对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶发酵过程的影响

利用重组毕赤酵母在7 L的发酵罐中进行分批补料高密度发酵,考察不同NH4+质量浓度对毕赤酵母基因工程菌表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,补加(NH4)2SO4溶液维持NH4+质量浓度在7 g/L时华根霉脂肪酶酶活最高,分别是不补加(NH4)2SO4溶液、补加并维持NH4+质量浓度在5 g/L、10 g/L条件下的1.41、1.11、1.08倍,而且在该氮源质量浓度条件下,胞外总蛋白质质量浓度最高,达到5.61 g/L。通过分析不同氮源条件下发酵参数比生长速率、产物比形成速率和底物比消耗速率的差异,发现发酵维持NH4+质量浓度在7 g/L时,产物比形成速率和底物比消耗速率均较高,这与该条件下产酶水平最高相一致。研究结果表明,对毕赤酵母基因工程菌发酵过程中的氮源进行优化,能够明显促进外源蛋白质的表达。     

克氏担孢酵母脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯（C18）。     

微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中的诱导表达研究

目的:研究重组毕赤酵母GS115PJ5诱导表达微小毛霉凝乳酶过程中酵母生长、产酶及培养液总蛋白变化情况。方法:测定毕赤酵母生长曲线、凝乳酶凝乳活性、蛋白水解活性、培养基上清液总蛋白含量。结果:毕赤酵母在开始诱导24h后即进入稳定生长期,并保持到240h,然后进入衰亡期。SDS-PAGE显示在分子量约为47000处有目的凝乳酶条带,凝乳酶在培养144h后开始大量积累,酶活性迅速提高,192h时凝乳活性达到最大值300SU/mL,蛋白水解活性为10.75U/mL,凝乳活性与蛋白水解活性的比值（C/P）达到最大值27.9,上清液总蛋白含量为0.189mg/mL。结论:微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中得到了有效的表达。      

微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中的诱导表达研究

目的:研究重组毕赤酵母GS115PJ5诱导表达微小毛霉凝乳酶过程中酵母生长、产酶及培养液总蛋白变化情况。方法:测定毕赤酵母生长曲线、凝乳酶凝乳活性、蛋白水解活性、培养基上清液总蛋白含量。结果:毕赤酵母在开始诱导24h后即进入稳定生长期,并保持到240h,然后进入衰亡期。SDS-PAGE显示在分子量约为47000处有目的凝乳酶条带,凝乳酶在培养144h后开始大量积累,酶活性迅速提高,192h时凝乳活性达到最大值300SU/mL,蛋白水解活性为10.75U/mL,凝乳活性与蛋白水解活性的比值(C/P)达到最大值27.9,上清液总蛋白含量为0.189mg/mL。结论:微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中得到了有效的表达。     

重组毕赤酵母发酵生产扩展青霉碱性脂肪酶的优化

通过毕赤酵母工程菌表达碱性脂肪酶,对表达条件进行了优化。先进行单因素实验,筛选出对碱性脂肪酶表达影响较大的4个因素:诱导时间、初始pH、甲醇添加量和接种量;在单因素实验的基础上设计四元线性回归实验,利用SPSS18数据处理软件进行数据优化,结果表明,诱导时间为96h、初始pH为6.0、甲醇添加量为0.5%、接种量为150mL时有最佳的表达效果,碱性脂肪酶活力为242.7U/mL。     

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展

脂肪酶作为一种常见的工业用酶,广泛应用于食品、化妆品等与生活密切相关的工业领域,但较高的生产成本和使用成本,在一定程度上限制了其进一步应用。通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达系统重组表达脂肪酶,成为解决限制脂肪酶发展的方法之一。本文介绍了脂肪酶在P.pastoris表达系统中的异源表达及其优化策略,并对毕赤酵母表面展示异源脂肪酶的技术及应用进行了归纳。     

酵母分泌表达重组人神经生长因子

目的研究人神经生长因子基因工程制备工艺。方法构建了表达质粒pPIC9K/rhNGF,转化毕赤酵母,筛选多拷贝转化子,进行摇瓶表达,正交试验选择表达条件。结果得到高表达高外泌的工程菌,并确定了纯化步骤,经疏水层析和阳离子交换层析纯化后,取得高活性高纯度的rhNGF。结论为该药的规模生产奠定了基础。     

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展

脂肪酶作为一种常见的工业用酶,广泛应用于食品、化妆品等与生活密切相关的工业领域,但较高的生产成本和使用成本,在一定程度上限制了其进一步应用。通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达系统重组表达脂肪酶,成为解决限制脂肪酶发展的方法之一。本文介绍了脂肪酶在P.pastoris表达系统中的异源表达及其优化策略,并对毕赤酵母表面展示异源脂肪酶的技术及应用进行了归纳。