流感病毒H5N1在Vero细胞上培养条件的优化

目的优化流感病毒H5N1在Vero细胞上的培养条件。方法在Vero细胞上,用不同维持液[M199、M199+表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、MEM、MEM+EGF、无血清培养基(serum-free medium,SFM)]及含不同胰酶浓度(3、5、7μg/ml)的M199维持液培养流感病毒H5N1,收获培养上清,检测血凝滴度,确定最适维持液及胰酶浓度;用流感病毒H5N1感染细胞上清于冻融前后分别感染Vero细胞,连续传代,收获培养上清,检测血凝滴度,比较冻融对病毒增殖的影响。将流感病毒H5N1以0.01 MOI感染对数生长期Vero细胞,以优化后的培养条件培养,收获培养上清,检测血凝滴度及病毒感染性滴度,确定H5N1在Vero细胞上连续传代的稳定性。结果当维持液培养基为SFM、胰酶浓度为5μg/ml时,利用病毒收获液直接感染2代后,再将维持液培养基更换为M199时,血凝滴度最高。利用优化后的培养条件在Vero细胞上连续传代培养流感病毒H5N1,血凝滴度和感染性病毒滴度均较稳定。结论优化后的培养条件在Vero细胞上可连续稳定传代培养流感病毒H5N1,为建立工作种子批,用于大流感疫苗的制备奠定了基础。     

生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a的CHO细胞工艺的建立

目的建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律。结果 15 L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30%～70%,温度36.8～37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间。结论初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础。     

高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建

目的构建高效表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的CHO工程细胞株。方法从pCIneo质粒出发,构建含有改造了稀有密码子的HBsAgS基因和启动子弱化的二氢叶酸还原酶(DHFR)转录单位的新型表达载体,利用脂质体转染CHO/dhfr-细胞,经3轮氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选和单克隆筛选,获得高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,并对HBsAg的分泌动态进行检测。结果所构建的新型表达载体pCI-DS经PCR及酶切鉴定,证明构建正确,转染CHO/dhfr-细胞后,经筛选得到高效表达HBsAg的CHO工程细胞株3F9,表达量达9.21μg/106个细胞·48h。单层细胞培养动态表明,3F9株细胞能在40d内稳定高效表达HBsAg。结论已成功构建稳定高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,为提高HBsAg的产量创造了条件。     

国产试剂配制D-MEM与GIBCO生产的D-MEM比较

应用国产氨基酸、无机盐、葡萄糖等全部国产试剂,按 D-MEM 组成,自行配制的3D-MEM与 GIBCO 生产的 D-MEM 进行平行试验,比较对分泌 HBsAg 工程细胞的支持生长能力和产生 HBsAg 数量的效果。结果指出:二者未见有任何差别,无论细胞形态,维持细胞生长时间,细胞密度完全一样。分泌 HBsAg工程细胞在该培养液中连传7代,生长良好,长期培养核型无任何改变,用两种培养液培养该细胞,HBsAg分泌水平相同,均可达到反相血凝滴度1∶1024的水平。     

改良维持液培养aG株狂犬病病毒制备病毒原液

目的通过改良维持液的缓冲体系,改进aG株狂犬病病毒的培养条件,制备高滴度的病毒原液。方法在传统病毒维持液的基础上,补加缓冲盐和碳酸氢钠,在相同的条件下,分别用传统维持液和改良维持液培养病毒,收获2次病毒液,混合,经300 KD膜包超滤、Sepharose 4FF纯化后,制成病毒原液,采用ELISA法检测抗原含量,按《中国药典》三部(2010版)方法检测病毒滴度、效力、宿主DNA和宿主细胞蛋白残留量,用便携式pH计检测pH值。结果改良维持液制备的病毒原液的抗原含量、病毒滴度及效力均高于对照维持液;两种维持液制备的病毒原液的宿主蛋白和宿主细胞DNA残留量均符合《中国药典》三部(2010版)要求;改良维持液的缓冲能力明显增强,对病毒培养过程中pH值的控制明显优于对照维持液。结论改良维持液培养狂犬病病毒制备的病毒原液滴度较高,可改进传统aG株狂犬病病毒生产的病毒原液滴度较低的现状。     

应用国产改良型DMEM培养基培养CHO-C28细胞

目的 解决CHO-C28细胞在大规模培养过程中易增厚、脱落和不易维持的难题。方法 试验组用国产改良型DMEM培养基连续培养CHO-C28细胞2个月,对照组用进口和国产DMEM培养基,观察细胞贴壁、增殖、维持和分泌HBsAg情况。结果 试验组细胞贴壁和长满单层时间明显快于对照组,维持2个月细胞未出现增厚和脱落,分泌HBsAg量明显高于对照组。结论 使用国产改良型DMEM培养基培养CHO-C28细胞效果显著优于现用进口和国产DMEM培养基。     

两种细胞培养流感病毒的滴度比较

目的探讨甲1(A1)型流感病毒在Vero细胞和MDCK细胞培养的可行性,确定最佳培养条件。方法将流感病毒接种于Vero细胞和MDCK细胞,在含有不同浓度胎牛血清或胰酶维持液中培养,于不同时间收获病毒液,检测血凝素滴度(HA)。结果胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用。加入适量胰酶(约5μg/ml)可提高病毒产量。最佳收获病毒时间为72～96h。在MDCK细胞上的病毒HA滴度高于Vero细胞。结论两种组织细胞培养流感病毒结果相近,Vero细胞和MDCK细胞均可用于培养流感病毒。     

生物反应器培养Vero细胞和H1N1流感病毒

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1N1全病毒灭活疫苗的新工艺。方法利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3 L硅化生物反应器中进行培养,培养温度(37±0.5)℃,溶解氧(50±20)%,p H 7.2±0.2,搅拌速度(50±20)r/min,待细胞在微载体上长成单层后,以0.1 MOI接种流感病毒Vero细胞高产适应株H1N1/JD/Va,将收获的病毒液经Sepharose 4FF和Capto Q两级纯化,灭活后制备疫苗原液及成品,按照《中国药典》三部(2015版)方法对其进行检定。结果使用无血清细胞培养液培养Vero细胞24 h贴壁率约83%,含血清细胞培养液培养24 h贴壁率为112%;灌流培养方式培养至第6天时,细胞均长至单层,无血清细胞培养液最终细胞数达到(133.4±2.0)×10~4个/m L,含血清细胞培养液最终细胞数达到(353.4±5.9)×10~4个/m L。无血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为388,单位细胞产毒比例为2.9;含血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为891,单位细胞产毒比例为2.5。用含血清细胞培养液培养Vero细胞接种病毒,收获病毒液制备的疫苗原液及成品经检测,各项指标均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立了3 L生物反应器含血清细胞培养液培养Vero细胞和H1N1流感病毒的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

重组人红细胞生成素二聚体工程细胞的建立

目的建立重组人红细胞生成素二聚体工程细胞株。方法用重组人红细胞生成素二聚体表达载体转染COS-7细胞,通过dot blot进行检定。然后对CHO-dhfr-细胞进行稳定转染,再经过稀释克隆和MTX的加压扩增,筛选二聚体工程细胞株并进行传代及无血清培养基培养、目的蛋白纯化及检测。结果瞬时转染70h细胞有目的蛋白表达。稳定转染后选取表达量最高的细胞株为工程细胞株。该细胞株连续传15代及经无血清培养基培养,目的蛋白表达量均无明显下降。所表达的目的蛋白相对分子质量为70000,并具有高度特异性。结论已获得稳定高效表达重组人红细胞生成素二聚体的工程细胞株。     

无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞的比较

目的对无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞进行比较。方法应用两种培养基采用小方瓶培养CHO细胞,观察细胞维持时间、培养过程的形态变化及对血凝效价的影响。结果应用无血清培养基(A)培养CHO-C28细胞虽然可维持细胞正常生长,但贴壁不好,逐渐降低(A)加量情况可得到相应改善。结论 目前无血清培养基尚不能完全取代含血清培养基用于培养CHO细胞。     

抗rhTNFα杂交瘤细胞的体外培养及抗体分泌的研究

采用非CO2依赖培养基（CO2-IM）在无CO2、37℃条件下培养抗rhTNFα杂交瘤细胞，培养1周PH无显著变化，细胞生长趋势和抗体分泌显著超过DMEM。将CO2－IM与SFPF－HM混合后添加ITSE可以培养抗rhTNF杂交瘤细胞，其细胞生长速率、密度、活力和抗体产量均达到或超过含血清培养。     

微载体培养Marc145细胞实验条件的优化

目的优化Marc145细胞在微载体上的生长条件。方法对微载体培养Marc145细胞的细胞接种密度、微载体浓度和细胞培养基等培养过程中的关键工程参数进行优化。结果以微载体细胞密度4×104个/mg、微载体浓度7mg/ml在高糖DMEM(含30mmol/L葡萄糖,6mmol/L Gln)培养基中培养,48h后每12h换液50%的培养方式效果最为理想。结论优化的培养工艺适用于病毒疫苗的生产。     

Effects of Proteins from Culture Medium on Surface Property of Silanes- Functionalized Magnetic Nanoparticles

Monodisperse magnetic nanoparticles (MNPs) were synthesized by thermal decomposition of iron-oleate and functionalized with silanes bearing various functional groups such as amino group (NH₂), short-chain poly(ethylene glycol) (PEG), and carboxylic group (COOH). Then, silanes-functionalized magnetic nanoparticles (silanes-MNPs) were incubated in cell culture medium plus fetal calf serum to investigate the effects of proteins from culture medium on surface property of MNPs. Zeta potential measurements showed that although surface charges of silanes-MNPs were different, they exhibited negative charges at neutral pH and approximate isoelectric points after they were incubated in cell culture medium. The reason was that silanes-MNPs could easily adsorb proteins from culture medium via non-covalent binding, resulting in the formation of protein-silanes-MNPs conjugates. Moreover, silanes-MNPs with various functional groups had different adsorption capacity to proteins, as confirmed by Coomassie blue fast staining method. The in vitro cell experiments showed that protein-silanes-MNPs had higher cellular uptake by cancer cells than silanes-MNPs.     

Hela细胞高密度悬浮培养的研究

应用1.5L Celligen细胞培养罐,通过加大培养基的更换量,实现了Hela细胞高密度悬浮培养,细胞浓度达1.1×10~7/ml,每周可收获10~(10)以上的活细胞。     

表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养

目的优化表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的重组CHO细胞的无血清培养基,并进行生物反应器高密度培养。方法通过对现有重组CHO细胞无血清培养基SFMB的氨基酸、蛋白类激素、蛋白水解物等的优化,建立针对表达HBsAg的重组CHO细胞无血清低蛋白(<10mg/L)培养基SFMC。并利用此培养基在生物反应器中分批、流加、灌注悬浮培养重组CHO细胞,通过最大细胞密度和HBsAg产率评价不同的培养模式。结果 SFMC与原培养基SFMB相比,使重组CHO细胞的最大细胞密度提高了20%,HBsAg表达量提高了25%。在生物反应器培养过程中,灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg/(L·d),较分批和流加培养的0.30mg/(L·d)提高了约133%。结论通过无血清培养基优化及生物反应器高密度培养,可显著提高重组CHO细胞表达HBsAg的效率。     

人呼吸道合胞病毒A_2株在不同细胞中的培养及其影响因素

目的在不同细胞中培养人呼吸道合胞病毒(HRSV),并分析其影响因素,为病毒的大量增殖创造条件。方法将HRSVA2株分别接种至人二倍体KMB17细胞、Vero细胞、人喉癌Hep-2细胞及HeLa细胞进行培养,采用微量细胞病变法检测病毒的感染性滴度,并进行间接免疫荧光试验及合胞体观察。检测吸附时间、维持液pH值和培养温度对病毒增殖的影响。结果4种细胞中,Vero细胞对HRSV最敏感,病变早、病毒感染性滴度可达6.83lgCCID50/ml;KMB17细胞相对敏感性不高,但仍能良好增殖,病毒感染性滴度达6.13lgCCID50/ml;Hep-2细胞及HeLa细胞介于Vero细胞和KMB17细胞之间,病毒感染性滴度也达到6.83lgCCID50/ml。间接免疫荧光试验显示病毒在细胞浆内增殖。吸附时间对HRSV的增殖无明显影响;维持液的pH值对HRSV的增殖及病变特点均有一定的影响,在pH7.0～7.2时可快速引起细胞产生病变,并能达到最高感染性滴度;HRSV在37℃及32℃下培养均能良好地增殖。结论HRSVA2株在KMB17、Vero、Hep-2及HeLa细胞内均可增殖,但敏感性有一定差异,且对培养条件有一定的要求。     

枯草芽孢杆菌出芽培养条件优化

探索了提高枯草芽孢杆菌产生芽孢的方法,使用单批一次投料培养法研究了培养基成分、p H值、培养过程中通气量及装液体积比对菌体产芽孢的影响。试验结果说明:枯草芽孢杆菌最适生长和产生芽孢的碳源是糖蜜,最适氮源是酵母浸粉;二价锰离子和无机盐对菌体的生长和产芽孢有很大影响。菌体生长和产芽孢的最适培养基组成:糖蜜1.0%,酵母粉0.8%,(K2HPO4+KH2PO4)0.5‰,Mn SO4 0.2‰;产芽孢的最适条件:开始培养p H值为7.0,最适装液量为20%(体积比)。在5L半自动发酵罐中,溶氧大于70%,发酵24 h后,芽孢数量为5.1×1011CFU/m L,出芽率为98.0%。     

Evaluation of MC3T3-E1 Cell Osteogenesis in Different Cell Culture Media

Many biomaterials have been evaluated using cultured cells. In particular, osteoblast-like cells are often used to evaluate the osteocompatibility, hard-tissue-regeneration, osteoconductive, and osteoinductive characteristics of biomaterials. However, the evaluation of biomaterial osteogenesis-inducing capacity using osteoblast-like cells is not standardized; instead, it is performed under laboratory-specific culture conditions with different culture media. However, the effect of different media conditions on bone formation has not been investigated. Here, we aimed to evaluate the osteogenesis of MC3T3-E1 cells, one of the most commonly used osteoblast-like cell lines for osteogenesis evaluation, and assayed cell proliferation, alkaline phosphatase activity, expression of osteoblast markers, and calcification under varying culture media conditions. Furthermore, the various media conditions were tested in uncoated plates and plates coated with collagen type I and poly-L-lysine, highly biocompatible molecules commonly used as pseudobiomaterials. We found that the type of base medium, the presence or absence of vitamin C, and the freshness of the medium may affect biomaterial regeneration. We posit that an in vitro model that recapitulates in vivo bone formation should be established before evaluating biomaterials.     

在无血清无蛋白培养基中培养Vero细胞

目的开发在无血清无蛋白培养基(PF)中培养Vero细胞的技术。方法在DMEM/F12培养基中添加酵母提取物和大豆水解物,配制成无血清无蛋白培养基。使用配制好的无血清无蛋白培养基,分别在玻璃、聚乙烯醇缩丁醛(PVB)和聚苯乙烯(PS-TC)培养面上培养Vero细胞,观察细胞生长情况,并绘制细胞生长曲线,以含血清培养基BM为对照。结果与BM培养基比较,在玻璃培养面上,PF培养基不支持Vero细胞生长和分裂;在PVB培养面上,PF培养基支持Vero细胞生长,但不支持分裂;在PS-TC培养面上,PF培养基支持Vero细胞的生长和分裂。结论在PS-TC培养面上,PF培养基适合培养Vero细胞。