应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

利用双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则,以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE 基因为靶基因设计一对DPO引物,经过反应体系的优化,建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DPO-PCR检测方法, 其检测灵敏度约为94 CFU/mL。与常规PCR方法相比,所建立的DPO-PCR方法对退火温度不敏感,在引物设计和实 验过程中不需要对引物及其退火温度反复优化,同时基于DPO引物的特殊结构又增强了其特异性。DPO-PCR方法 设计简易、特异性强,为致病性微生物的快速准确检测提供了新途径。     

食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测技术研究进展

近年来,因食源性致病菌造成的食品中毒正在不断增加,严重威胁了人类的健康,大肠杆菌（E.coli） O157∶H7由于其低感染剂量和高致病性等特点引起了研究人员和世界卫生组织的高度重视。因此精准快速的检测食品中的E.coli O157∶H7对食品安全问题有着重要的意义,是预防和控制食源性疾病传播的重要技术,为此本文对E.coli O157∶H7的常规检测方法、免疫学法、分子生物学法和其他方法进行论述,介绍了这些方法的优缺点,对各种方法进行了整体比较,以期为有关工作者在选择检测方法或研发新方法提供参考。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7的分子生物学检测及PCR检测

大肠杆菌一些特殊的血清型具有致病性,肠出血性大肠杆菌是大肠杆菌的一个亚型,主要致病菌株为O157:H7,可引起感染性腹泻,因能引起人类的出血性肠炎而得名。本文综述了分子生物学检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的研究进展。分子生物学检测是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法,主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体免疫金层析法以及免疫磁珠分离法(IMS)。PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7,主要包括常规PCR检测、多重PCR检测以及实时荧光定量PCR检测。这两种方法灵敏度高、特异性强、操作简便、结果准确等优点,是检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的常用方法。     

出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体制备及免疫胶体金试纸条的研制

将骨髓瘤细胞SP2/0与出血性大肠杆菌O157∶H7免疫小鼠得到的脾细胞融合,通过筛选得到3株稳定分泌抗出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3、E7、B9,D3和B9亚类为IgG1,E7亚类为IgG2a,轻链亚型均为κ。交叉反应结果显示这3株单抗仅结合出血性大肠杆菌O157∶H7,对15株其他细菌无反应,测得胶体金标记单抗最佳pH、最佳结合量分别为D3:pH 7.5⁸.0、24μg/mL;B9:pH 7.5、12μg/mL;E7∶pH7.5、18μg/mL,抗体配对选择胶体金结合D3喷涂金标垫、E7以1 mg/mL喷涂NC膜作T线为最优组合,试纸条检测出血性大肠杆菌O157∶H7灵敏度为2.1×106CFU/mL,且仅可检出出血性大肠杆菌O157∶H7,对25株其他细菌均无交叉反应,模拟带菌实验表明,对市售面包、牛奶、果冻各25 g(mL)均添加约200 CFU出血性大肠杆菌O157∶H7,增菌培养8、10、10 h即可检出。研究表明,实验自主制备的抗体性能良好,试纸条特异性、灵敏度达到国外同类产品,可在政府食源性致病菌监管部门、食品企业推广运用。     

温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7污染状况调查

目的调查温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的污染状况,了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力因子的携带与耐药情况。方法采用分层随机抽样的方法,对2008—2011年抽取的231份食品样品,用免疫磁珠富集法对大肠杆菌O157∶H7进行分离,对该分离株进行生化、血清学鉴定,以纸片法(K-B法)进行药敏试验;采用PCR方法检测O、H抗原基因和stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因。结果 231份样品中,分离出1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7,检出率为0.43%;O157抗原和H7抗原的核酸检测结果阳性,但未检测到stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因,菌株对红霉素、利福平、150μg/片和10μg/片两种浓度的0/129(二氨基二异丙基喋啶磷酸盐)耐药。结论温州市食品中存在大肠杆菌O157∶H7的污染,检出率较低,但提示要加强主动监测,通过有效干预,防范肠出血性大肠杆菌O157∶H7所致食源性疾病的发生。     

基于可视化抗体宏阵列技术的出血性大肠杆菌O157∶H7定量检测

目的：探索建立一种新的出血性大肠杆菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）的快速定量检测技术。方法：以硝酸纤维素膜为基片,用生物芯片点样仪制作抗体宏阵列,采用“双抗夹心”原理,对出血性大肠杆菌O157∶H7进行定量检测研究。结果：本方法对出血性大肠杆菌O157∶H7的检出限为3.4×105 CFU/mL,在105～107CFU/mL细菌浓度范围内,宏阵列的灰度值与细菌浓度之间有较好的线性关系。该方法可在2.5 h内同步检测多个样品中出血性大肠杆菌O157∶H7的浓度。结论：通过用标准菌株、模拟带菌等研究显示,用宏阵列技术快速定量检测出血性大肠杆菌O157∶H7,结果肉眼可见,稳定准确,同时操作简便、成本低廉、无需大型设备,制作好的抗体宏阵列可用于快速评估食品中出血性大肠杆菌O157∶H7的污染状况,尤其适合于基层实验室进行快速高通量样品筛查。     

复合乳酸菌对肠出血性大肠杆菌O157∶H7抑制作用的研究

本研究利用实验室保存的7株常见乳酸菌进行抑制大肠杆菌O157∶H7实验,其中4株乳酸菌对大肠杆菌O157∶H7有明显抑制效果,分别为嗜酸乳杆菌(SL1)、鼠李糖乳杆菌(SL2)、干酪乳杆菌(SL3)、植物乳杆菌(SL4)。将4株乳酸菌混合后不但抑菌效果强于4株任意单独菌株,其发酵滤液pH相比4株单独菌株下降速度最快,且pH最低。说明混合后的乳酸菌产酸能力也明显增强。将SL1、SL2、SL3、SL4通过排列组合(C(n,m))可分成11组混合菌液,然后通过牛津杯抑菌方法进行抑菌实验,结果显示乳酸菌组合(SL2、SL3、SL4)具有最佳抑菌效果。再将SL2、SL3、SL4按正交设计方案以不同比例的接种量混合成复合菌剂进行抑菌实验,结果表明:乳酸菌组合(SL2、SL3、SL4)以3∶1∶3比例制备复合菌剂时,对大肠杆菌O157∶H7的抑制效果最好。      

肉桂精油抑制肠出血性大肠杆菌O157:H7活性研究

肠出血性大肠杆菌O157:H7(Enterohemorrhagic Escherichia coli 157:H7, EHEC O157)因具有生长繁殖快,污染途径广泛,高染病率和高致病率的特点成为最常见的食源性病菌之一。为探究肉桂精油对EHEC O157细胞膜特性和呼吸代谢的影响。以EHEC O157为研究对象,用不同浓度的的肉桂精油处理,37℃恒温振荡培养。结果显示,肉桂精油对EHEC O157的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为0.000 4 g/L。随精油处理时间的延长,菌液中核酸和蛋白质含量,β-半乳糖苷酶含量均逐渐上升;蛋白质含量,碱性蛋白酶(alkaline protease, AKP)活性逐渐下降;琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)活性先上升后下降。综上表明,肉桂精油对EHEC O157表现出良好的抑菌性,可以破坏菌体细胞膜,改变细胞膜表面特性,导致细胞膜通透性变大,胞内大分子物质流出,最终影响三羧酸循环。希望该研究为精油抑菌机制向分子层面深入拓展提供有效的理论依据。     

PCR-免疫胶体金试纸条方法检测食品中 肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的建立PCR-免疫胶体金试纸条法快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的分析方法。方法通过设计特异性引物建立肠出血性大肠杆菌O157:H7 PCR检测方法并使用免疫胶体金技术以及双抗体夹心法建立PCR产物快速检测试纸条并设计核酸检测展开液;将1株大肠杆菌O157:H7标准菌株和7株其他常见食源性致病菌作为试验菌株,用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度,并比较PCR-免疫胶体金试纸条法和PCR-琼脂糖凝胶电泳法的检测敏感度。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度,灵敏度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。结论本文建立的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好,灵敏度高,价格低廉,适用于食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测。     

食品中出血性大肠杆菌O157:H7检验方法的建立

Ｏ157:Ｈ7大肠杆菌是出血性大肠埃希氏菌 (Ｅｎｔｅｒｏ -ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ.ｃｏｌｉＥＨＥＣ)的一个常见的血清型。自1982年美国首次发生由Ｏ157:Ｈ7大肠杆菌引起的食物中毒小型爆发以来 ,欧美各国、日本相继有本菌所致疫情爆发的报道。已知Ｏ157:Ｈ7是一种以食物传播为主要传播途径的人畜共患疾病的病原菌 ,生食受污染的食品或饮用水可引发感染 ,有时可导致大规模爆发流行。我国同样存在Ｏ157:Ｈ7引发食物中毒的隐患 ,建立统一的食品中Ｏ157:Ｈ7检验方法迫在眉睫。为此 ,我们参考日本厚生省及ＵＳＤＡ检验方法 ,[2 ,5] 建立了适用于…     

出血性大肠杆菌H7鞭毛抗原的诱导恢复及鉴定

从进口冻鸡翅中分离获得一株发酵山梨醇、缺失H7鞭毛抗原的出血性大肠杆菌O157:H7变异株,采用0.4%强营养软琼脂对该菌进行连续5代诱导培养,使其H7鞭毛抗原成功恢复。综合该菌的生物学特性、血清学及毒理实验结果确证为大肠杆菌O157:H7。该菌的检出为大肠杆菌O157:H7变异株的鉴定提供了有益参考。     

出血性大肠杆菌O157:H7国内分离株耐酸性的研究

EHEC O157：H7难以控制的原因之一是该菌对酸的耐受性。将国内6株EHEC O157：H7在不同pH的LB溶液中振荡培养，每隔1h计数，实验结果表明了6株菌耐受时间相比较存在差异，菌株97063较其它菌株在pH2．5条件下，耐受时间长超过了29h。本实验旨在对EHEC O157：H7的国内分离株耐酸性进行研究，为控制EHEC O157：H7的感染提供科学依据。检验检疫部门、食品卫生部门等应高度重视对酸性食品中大肠杆菌O157：H7的检验。     

大肠杆菌O157:H7及其在食品中的检测

大肠杆菌O15 7:H7是一种感染剂量小 (10个活菌 ) ,危害性很大的致病菌。近年 ,在世界各地屡次发生大肠杆菌O15 7:H7的感染事件。因此 ,在食品卫生和安全领域 ,对大肠杆菌O15 7:H7致病机理、生物学特性、检测方法、预防和控制已成为研究热点。作者对大肠杆菌O15 7:H7的致病性、生化特性、检测方法及其在食品中出现的情况作了系统的介绍     

一株肠出血性大肠杆菌O157H7免疫奶牛实验即抗EHEC O157H7免疫乳的试制

用1株O157H7菌株和另外11株人类肠道主要病原细菌配制O157H7单菌疫苗和多菌联合多价疫苗,对荷斯坦牛进行免疫实验。对免疫常乳中抗EHEC O157H7特异性抗体凝集价进行了长期监测,并对受试奶牛的免疫反应、应激反应及疫苗对奶牛可能产生的毒性作用进行了观察。结果证明,疫苗免疫效果很好,所有奶牛在整个泌乳期一直保持较高的特异性抗体效价(滴度),均在27以上,下个泌乳期开始阶段也未见明显下降的迹象。本次实验意外发现约有30%的未进行过免疫注射的对照组乳样有较高的O157H7特异性抗体滴度,个别乳样凝集价高达27,这可能说明这些牛群中有较高的O157H7感染率或携带率。O157H7是人类近二十余年来才开始认识到的出血性结肠炎(HC)的主要致病菌,能造成出血性腹泻和其它严重并发症。是值得研究和重点防范的病原细菌。     

F0F1-ATPase生物传感器检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7

目的 研究F0F1-ATPase纳米生物传感器在肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测中的应用, 开发高灵敏、特异性强的快速检测技术。方法 利用免疫技术构建信号识别元件, 根据F0F1-ATPase酶学机制建信号转化系统, 建立免疫生物传感器, 最后通过荧光扫描仪进行信号检测。本研究以食品中常见的大肠埃希菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella typhi)为干扰菌株进行了该方法的特异性研究。结果 检测时间为4.5 h, 102～104 cfu呈现良好的梯度性和线性, R2=0.9818。空白对照组和102 cfu/孔均与104 cfu/孔组存在极显著性差异, P值分均为P = 0.00＜0.01。结论 F0F1-ATPase纳米生物传感器对O157:H7检测快速、灵敏、特异性好, 有良好的应用前景。     

改良热酚水法制备大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的研究

采用热酚水法提取肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157∶H7的脂多糖（LPS）,经浓缩酶解,离心分离得纯化LPS,酸解制得O-特异性侧链（O-PS）,能有效去除核酸及杂蛋白,抗原具有鲎试剂凝集活性及对产蛋鸡有较强的免疫原性,建立了一种改良热酚水法提取制备O157∶H7特异性脂多糖抗原的方法.     

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的研制

采用胶体金标记抗大肠杆菌O157:H7 单克隆抗体(鼠源),通过将大肠杆菌O157:H7 多克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,研制大肠杆菌O157:H7 胶体金快速检测试纸条。通过优化实验,确定最佳条件为标记量16.8μg/mL、标记pH8.0、封闭剂PEG20000、检测时样品最佳pH7.0～7.5。对26 株常见细菌交叉反应结果表明,该试纸条除与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311 和金黄色葡萄球菌CMCC 26003 有轻微交叉反应外,与其他24 株菌均无交叉反应。该试纸条灵敏度为104CFU/mL。用该试纸条检测大肠杆菌O157:H7操作简便、快捷、灵敏度高、特异性强。     

Immunoliposomes Sandwich Fluorometric Assay (ILSF) for Detection of Escherichia coli O157:H7

ABSTRACT: We report the development of automated flourometric immunoassay for the detection of Escherichia coli O157:H7, using antibody-directed liposomes (immunoliposomes) encapsulating fluorophore as an analytical reagent. Thiolated antibodies (anti- E. coli O157:H7) were coupled to malemide-tagged liposomes encapsulating dye. To automate the assay, a fluorescence plate reader was included in the assay system to detect fluorophore released from lysed liposomes in a microplate. The detection limit of the current assay with pure cultures of the serotype was about 10⁴ colony-forming units (CFU)/mL. The assay can detect E. coli O157 in ground beef samples inoculated with as few as 0.8 CFU/mL after a 12-h enrichment. These results demonstrate the feasibility of using fluorophore-encapsulated immunoliposomes in a microtiter plate for the rapid and automated detection of molecules with multivalent antigenic sites.