Atp11c基因诱捕小鼠遗传背景分析

目的利用PCR(polymerase chain reaction,PCR)和荧光竞争性PCR技术对构建的Atp11c基因诱捕小鼠的遗传背景进行分析。方法通过PCR技术鉴定基因诱捕载体的插入位点和宿主染色体的缺失状态;利用荧光竞争性PCR技术检测宿主染色体内的诱捕载体拷贝数。结果 54对引物的PCR结果确定了诱捕载体在Atp11c第一个内含子中的插入位点,测序结果显示伴随着基因诱捕载体两端大于200 bp的碱基缺失,宿主染色体片段出现了418 bp的碱基删除;荧光竞争性PCR证实诱捕载体为单拷贝整合。结论成功解析了Atp11c基因诱捕小鼠的遗传背景,建立了快速、准确检测诱捕小鼠遗传背景的方案。     

利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除的初步研究

对利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除做了初步的探索,为进一步应用该技术进行小鼠基因功能研究奠定了基础.利用基因诱捕载体转染小鼠ES细胞,获得了36株neo基因单拷贝整合的诱捕ES细胞,其中14株细胞表达有活性的β半乳糖苷酶.将3株诱捕ES细胞分别经显微注射引入到受体囊胚中,再植入假孕母鼠的子宫中使其发育成小鼠.两株细胞得到了程度不同的嵌合体小鼠,其中一株诱捕ES细胞整合至生殖系.利用质粒拯救实验获得了诱捕载体整合位点附近的基因组序列,通过序列比对发现被诱捕的基因可能是一个新基因.X-gal染色结果显示,该基因的表达局限于小鼠腹部及肢芽的部位.     

利用基因诱捕识别哺乳动物发育调控基因

ES细胞是一种来源于胚胎的多潜能细胞,它可在体外培养并进行基因操作,而且通过囊胚注射制作嵌合体的途径,能将外源基因掺入小鼠的基因库中,因此利用ES细胞可筛选出发生基因突变的小概率事件并获得其遗传突变体．利用基因诱捕载体与ES细胞,研究与哺乳动物发育调控有关的未知基因,这一新技术将成为阐明胚胎发育过程中基因表达的时空格式的有效手段．     

用基因诱捕法制作Ayu17-449基因敲除小鼠模型

为了探明Ayu17-449基因在小鼠生长发育过程中的功能, 用特殊的诱捕载体（Gene trapping vector）导入小鼠ES细胞中,5′RACE、Southern blot方法鉴定成功地单一捕获Ayu17-449基因后,由这种ES制作了Ayu17-449 敲除小鼠并用Northern blot方法该基因在突变小鼠体内的表达。结果在Ayu17-449 敲除小鼠体内,诱捕载体位于Ayu17-449基因的翻译起始密码上游,Ayu17-449基因的转录被抑制。表明Ayu17-449敲除小鼠为分析Ayu17-449基因的功能提供了可靠的实验材料。      

启动子诱捕在棉花基因组中的功能分析

利用根癌农杆菌介导的遗传转化,将启动子诱捕（Promoter trapping）元件插入到棉花基因组,获得141个独立的转化子,其中97％的转化子经PCR扩增为阳性。不同组织中GUS基因的表达频率为：根部48％,茎的微管组织9．2％,叶5．2％,花51％;同时检测了不同植株中GUS基因的表达模式,发现GUS基因在不同株系的植株间的表达模式呈现较大的差异,有些植株中GUS基因是组织特异表达,有些则是器官特异表达,有些则在多个器官中均有表达。所建立的启动子诱捕系统中的GUS基因高频率、多模式和时空特异性表达为分离基因及其调节序列、开展功能基因组研究奠定了坚实的基础。     

亚洲玉米螟性诱剂诱捕器诱捕效果研究

研究了不同类型诱捕器、诱捕器悬挂高度及诱捕器颜色对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée)的诱捕效果,结果表明,水盆式和三角式两种诱捕器的诱捕效果较好,日均诱蛾量分别为0.7和0.6头,周诱蛾量分别为12.7和10.3头,总诱蛾量分别为46.3和41.3头,均与瓶水式、飞翼式诱捕器的日均诱蛾量、周诱蛾量和总诱蛾量显著差异;三角式诱捕器悬挂在2.5 m和2.0 m处的诱捕效果较好,日均诱蛾最分别为0.7和0.6头,周诱蛾量分别为11.0和10.3头,总诱蛾量分别为43.7头和41.3头.颜色对诱捕器的诱捕效果影响不大,红、白、黄、绿四种不同颜色的三角式诱捕器的13均诱蛾量、周诱蛾量和总诱蛾量均差异不显著.     

实蝇类昆虫的引诱剂和诱捕器

实蝇科昆虫的许多种类是重要的入侵物种, 在国际植物检疫领域具有重要地位。联合国粮农组织（FAO）和《国际植物保护公约（IPPC）》积极倡导国际合作实施对实蝇类害虫的有效控制, 不断完善和出版实蝇控制技术手册并制定相关的国际植物检疫标准。引诱剂和诱捕器是实蝇类害虫监测、调查和防治中最重要的手段之一, 被广泛采用。国际上普遍认可的实蝇诱剂主要包括蛋白质诱剂（PA)、甲基丁香酚（ME）、诱蝇酮（CUE）、乙酸铵诱剂（AA）、乙酸铵盐诱剂（AS）、TML 诱剂、己酸丁酯诱剂（BuH）、吡嗪诱剂（MVP）等, 我国也研发了大量植物型和食物型诱剂。国际上常用实蝇诱捕器有20多种, 依据捕获实蝇的不同方式分为干型诱捕器、湿型诱捕器和干湿综合型诱捕器3类。同时, 我国利用各种塑料瓶研制了多种多样的诱捕器。本文对国际、国内实蝇诱剂和诱捕器等研究和利用情况进行了总结, 提出我国在建设外向型水果非疫区的实蝇监测中应使用国际标准的诱剂和诱捕器, 以便获得国际认可并促进我国优势农产品顺利进入国际市场, 在研发诱剂和诱捕器时做到标准化并及时申请专利保护、推向国际市场以便获得国际有关标准的采用和认可。     

三种性信息素诱捕器对烟田棉铃虫的诱捕效果比较

比较了笼罩、水盆、盘式粘胶诱捕器对烟田棉铃虫的诱捕效果。结果表明,3种诱捕器的诱蛾量变化趋势基本一致,其中笼罩诱捕器的诱蛾量最大,显著高于另外两种诱捕器,且诱捕效果比较稳定。水盆、盘式粘胶诱捕器诱蛾量差异不显著。笼罩诱捕器更适用于烟田棉铃虫成虫的防治及监测。     

用性信息素诱捕法防治槐小卷蛾研究

林间试验研究了用合成性信息素（反,反）－8,10－十二碳双烯－1－醇（E8,E10－12,OH）和（反,反）－8,10－十二碳双烯乙酸酯（E8,E10－12,Ac)(2:3)诱捕法防治行道树害虫槐小卷蛾（Cydia trasias Meyrick)的防治效果,诱捕区长500米,宽40米,三角形粘胶诱捕器悬挂在距地面约3m的国槐树侧枝上,诱捕器间距约15m,共悬挂62个诱捕器,对照区长250m,与诱捕区相距400米,防治效果用活雌蛾诱捕器,粘翅活雌蛾交配率以及国槐叶柄和果荚的受害率进行评价,槐小卷蛾一年有3次成虫发生高峰期,雌雄性比接近1：1,在诱捕区内,越冬代,第一代和第二代成虫发生期间分别诱集到雄蛾2268,2149和2342头,在越冬代和第二代成虫发生盛期,诱捕区内活雌蛾诱捕器诱捕雄蛾的数量比对照区明显减少（P＜0．01）,诱捕区内粘翅雌蛾的交配率比对照下降86．0％,在第一代,第二代和第三代幼虫为害盛末期,诱捕区内叶柄及果荚被蛀率分别比对照降低63．51％,68．47％和73．45％（P＜0．01）,试验结果表明,用合成性信息素诱捕法防治槐小卷蛾效果明显,前景广阔。     

T-DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用

T-DNA介导的基因诱捕技术是近年来发展起来的鉴定和分离基因的方法。在拟南芥和水稻基因组测序已经完成的今天, 该技术将在两者基因功能的研究中扮演举足轻重的角色。本文就T-DNA介导的基因诱捕系统、 基因克隆和突变体库构建的研究进展及其在植物功能基因组学上的应用等内容进行了综述, 并讨论了该技术应用中的一些问题。     

基因陷阱

本文综述了功能基因组学研究中的新热点——基因陷阱的原理与方法,应用和优缺点。     

基于启动子捕获系统的水稻基因的分离

为了分离水稻的基因及其启动子,该实验室构建了T-DNA(GUS)结构的水稻启动子捕获系统,对其中编号为113#、T-DNA单拷贝插入、GUS报告基因为组成型表达的阳性捕获系进行了进一步分析。潮霉素筛选结合GUS组织化学染色获得了T-DNA插入的纯合株(113#-22和113#-26);Inverse法分离得到T-DNA插入位点水稻基因组DNA旁邻序列,测序和BLAST结果表明,T-DNA反方向插在水稻基因组4号染色体预测基因的内含子中;扩增T-DNA插入位点上游2kb左右DNA片段,构建启动子分析质粒转化水稻‘中花11’胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS组织化学染色模式与113#阳性株系一致。结果表明,该预测基因及其启动子是利用启动子捕获系统所捕获到的候选基因。     

分泌蛋白特异性基因陷阱的设计与验证

蛋白质分子向细胞外分泌的过程有赖于信号肽的介导.基因陷阱是功能性基因克隆的一种有效方法,经典的基因陷阱以geo作为报告基因,对所克隆的基因类型没有选择性.将绿脓杆菌外毒素、2A序列、IL-2受体穿膜区以及新霉素磷酸转移酶的基因依次融合构建新型报告基因——peo,该报告基因能够特异性地甄别具有信号肽编码序列的基因.为验证peo对信号肽编码序列的特异性甄别作用,以peo为报告基因,构建了3种质粒载体,分别模拟用基因陷阱载体进行筛选时可能出现的3种情况,通过转染HeLa细胞、G418筛选以及碱性磷酸酶检测,证明peo能够有效地区分信号肽和非信号肽编码序列,以peo为报告基因改造的基因陷阱载体可以用于分泌蛋白基因的筛选.     

An Avian Sarcoma/Leukosis Virus-Based Gene Trap Vector for Mammalian Cells

RCASBP-M2C is a retroviral vector derived from an avian sarcoma/leukosis virus which has been modified so that it uses the envelope gene from an amphotropic murine leukemia virus (E. V. Barsov and S. H. Hughes, J. Virol. 70:3922-3929, 1996). The vector replicates efficiently in avian cells and infects, but does not replicate in, mammalian cells. This makes the vector useful for gene delivery, mutagenesis, and other applications in mammalian systems. Here we describe the development of a derivative of RCASBP-M2C, pGT-GFP, that can be used in gene trap experiments in mammalian cells. The gene trap vector pGT-GFP contains a green fluorescent protein (GFP) reporter gene. Appropriate insertion of the vector into genes causes GFP expression; this facilitates the rapid enrichment and cloning of the trapped cells and provides an opportunity to select subpopulations of trapped cells based on the subcellular localization of GFP. With this vector, we have generated about 90 gene-trapped lines using D17 and NIH 3T3 cells. Five trapped NIH 3T3 lines were selected based on the distribution of GFP in cells. The cellular genes disrupted by viral integration have been identified in four of these lines by using a 5' rapid amplification of cDNA ends protocol.     

Isolation of Novel CreERT2-Driver Lines in Zebrafish Using an Unbiased Gene Trap Approach

Gene manipulation using the Cre/loxP-recombinase system has been successfully employed in zebrafish to study gene functions and lineage relationships. Recently, gene trapping approaches have been applied to produce large collections of transgenic fish expressing conditional alleles in various tissues. However, the limited number of available cell- and tissue-specific Cre/CreER^T2-driver lines still constrains widespread application in this model organism. To enlarge the pool of existing CreER^T2-driver lines, we performed a genome-wide gene trap screen using a Tol2-based mCherry-T2a-CreER^T2 (mCT2aC) gene trap vector. This cassette consists of a splice acceptor and a mCherry-tagged variant of CreER^T2 which enables simultaneous labeling of the trapping event, as well as CreER^T2 expression from the endogenous promoter. Using this strategy, we generated 27 novel functional CreER^T2-driver lines expressing in a cell- and tissue-specific manner during development and adulthood. This study summarizes the analysis of the generated CreER^T2-driver lines with respect to functionality, expression, integration, as well as associated phenotypes. Our results significantly enlarge the existing pool of CreER^T2-driver lines in zebrafish and combined with Cre–dependent effector lines, the new CreER^T2-driver lines will be important tools to manipulate the zebrafish genome.     

Gene and Enhancer Trap Transposable Elements Reveal Oxygen Deprivation-regulated Genes and their Complex Patterns of Expression in Arabidopsis

Transposon tagging with modified maize Ds–GUS constructswas used to isolate genes induced by oxygen deprivation in Arabidopsisthaliana. Seedlings of 800 gene-trap (DsG) and 600 enhancer-trap(DsE) lines were grown on vertically positioned plates for 1 week,oxygen deprived for up to 24 h and stained for GUS activity.Oxygen deprivation induced intricate patterns of gene expressionin seedlings of 65 lines. The insertion site and phenotypesof 15 lines were examined. Surprisingly, none of the insertionswere into genes that encode known anaerobic polypeptides. Insertionswere identified within or adjacent to genes encoding proteinsof regulatory, enzymatic, mitochondrial protein import and unknownfunction, as well as adjacent to genes encoding a putative receptor-likekinase and putative sensor-histidine kinase. Four lines hadsignificantly lower ADH activity after 24 h of oxygen deprivationand three of these showed reduced stress tolerance. Two lineswith wild-type levels of ADH were low-oxygen intolerant. Paradoxically,several lines had significantly higher ADH activity after 12 hof oxygen deprivation but reduced stress tolerance. Caffeinetreatment, which increased ADH specific activity in wild-typeseedlings under aerobic conditions, was sufficient to increaseGUS staining in seven of the 15 lines, providing evidence thatthese genes may be regulated by cytosolic calcium levels. Theseresults demonstrate the effectiveness of the Ds–GUS taggingsystem in the identification of genes that are regulated inresponse to oxygen deprivation and a calcium second messenger.