高剂量化疗联合自体外周血造血干细胞移植时骨髓及外周血采集物中CD34+细胞黏附分子的表达

本研究的目的是应用免疫荧光直接三色标记和流式细胞术(FCM)，观测高剂量化疗(HDC)联合自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)时不同阶段的骨髓及外周血CD34^ 细胞，表达CD54、CD49d和CD62L的情况，探讨不同来源的CD34^ 细胞表达黏附分子的差异及其临床意义。将动员前、干细胞采集后和移植结束而骨髓重建后的骨髓样本及每次外周血单个核细胞样本，以CD34-PE和CD45-PerCP标记的同时，分别加CD54-FITC、CD49d—FITC、CD62L—FITC直接三色荧光标记．应用FACS测定CD34^ 细胞及各黏附分子表达情况，并比较不同时段骨髓中各类黏附分子表达的差异，以及外周血造血干细胞采集物与动员前骨髓中各类黏附分子表达的差异。结果表明．动员前、采集后及移植重建后骨髓中CD34^ 细胞对CD54、CD49d和CD62L表达的变化无统计学差异；造血干细胞第1和第2次采集物之间CD34^ 细胞对CD54、CD49d和CD62L的表达变化也无统计学差异；而造血干细胞采集物中CD34^ 、CD49^ 细胞较之动员前骨髓中CD34^ CD49d^ 细胞明显减少(P=0．001)。结论：化疗联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的动员方法，可使骨髓中CD34^ 细胞的CD49d表达下调，并使之动员而进入外周血，移植重建后骨髓中CD34^ 细胞的CD49d表达趋于正常，其进一步的临床意义有待更多的病例积累予以阐明。     

基质细胞衍生因子-1及其受体在G-CSF诱导的造血干/祖细胞动员中的作用

目的探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其特异性受体CXCR4在G-CSF诱导的造血干／祖细胞（HSPC）动员中的作用。方法应用酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫组织化学、流式细胞术等方法检测健康供者稳态及G-CSF动员过程中骨髓、外周血SDF-1／CXCR4的变化，并应用SDF-1中和性抗体阻断BALB／c小鼠SDF-1信号通路，进一步验证SDF-1／CXCR4在动员中的作用。结果G-CSF动员前骨髓和外周血的SDF-1浓度分别为（7．23±0．66）μg/L和（5．43±0．35）μg／L，动员后分别为（5．88±1．03）μg／L和（5．42±0．52）μg/L。动员后骨髓SDF-1蛋白水平下降（P＜0．05），骨髓和外周血之间的SDF-1浓度梯度消失（P＞0．05）；稳态骨髓、动员后骨髓和动员后外周血的CD34^＋ CXCR4^＋细胞在CD34^＋细胞群中的比例分别为（40．98±21．56）％、（65．80±24．68）％和（27．54±26．03）％。动员后CXCR4在骨髓CD34^＋胞上表达增加（P＜0．05），而外周血CD34^＋细胞CXCR4表达降低（P＜0．05）。SDF-1中和性抗体可降低G-CSF动员的BALB／c小鼠外周血成熟白细胞和祖细胞集落数量（P＜0．05）。结论骨髓中SDF-1水平的降低以及CXCR4在HSPC上表达的下降促进了G-CSF介导的动员的发生。     

粒系集落刺激因子对外周血T淋巴细胞亚群的影响及与CD34+细胞动员效果的相关性

本研究观察粒系集落刺激因子(G—CSF)作为造血干细胞动员剂对外周血T淋巴细胞亚群的影响及与CD34^ 细胞动员效果的关系。对26例行自体造血干细胞移植患在G—CSF动员前后收集外周血标本，用流式细胞术检测动员前后CD3^ 、CD3^ CD4^ 、CD3^ CD8^ 、CD3^ CD4^ CD8^ 及CD3^ CD4^-CD8细胞绝对数量的变化并与外周血CD34^ 细胞的动员效果进行相关性分析。结果表明：GCSF动员后外周血CD3^ 、CD3^ CD4^ 、CD3^ CD4^ CD8^ 及CD3^ CD4^-CD8细胞的绝对数量分别增加2.23，2．62，2.99及10．96倍，而CD3^ CD4^ CD8^ 细胞的变化无统计学意义(P=0．243)。各亚群细胞的变化与CD34^ 细胞动员效果比较，仅CD3^ CD4 CD8细胞的变化与CD34^ 细胞动员效果间具有良好的相关性，r=0．796，P=0.000。结论：G—CSF将造血干细胞由骨髓动员到外周血的同时，使外周血中T细胞亚群的绝对数量发生不同程度的变化。在各T淋巴细胞亚群中CD3^ CD8^-细胞的增加与CD34^ 细胞的动员效果间具有统计学意义的相关性。     

VLA-4整联蛋白和造血细胞迁移之间的相关关系研究

为了阐明VLA-4(CD49d)和造血细胞迁移方向之间的相关关系，将重组人G—CSF稀释后注射于小鼠皮下，以流式细胞仪检到不同时间后Sca-1^ 细胞表面CD49d的表达，并分析Sca-1^ 细胞计数与CD49d表达之间的相关关系。结果表明，注射G—CSF后骨髓和外周血的CD49d的表达都明显下降，同时在第7—9天外周血Sca-1^ 细胞数达到高峰，骨髓有核细胞数下降。而随着CD49d的表达回升，外周血Sca-1^ 细胞数下降，骨髓细胞数却又有增多趋势。结论：VLA-4介导造血细胞与骨髓微环境的粘附，调节CD49d的表达可能合导致造血细胞在骨髓和外周血之间相互迁移。     

rhG-CSF动员的外周血采集物与稳态骨髓中CD4^＋CD8^＋初始及记忆T细胞亚群的比较

本研究探讨重组人粒细胞集落刺激因子（rhG—CSF）动员的外周血采集物（G—PB）与稳态骨髓（SS—BM）中CD4^＋、CD8^＋初始、记忆T细胞亚群的差异。依据细胞表面CIM5RA和CD62L的表达将CD4^＋、CD8^＋T细胞划分为初始T细胞（naive，CIM5RA^＋CD62L^＋）、中心记忆T细胞（centralmemory，TCM，CIM5RA—CD62L^＋）、效应记忆T细胞（effeetor memory，TEM，CIM5RA^-CD62L^-）、终末分化效应记忆T细胞（terminally difierentiated effeetor memory，TTTp，CIM5RA^＋CD62L^-）。用流式细胞仪测定G—PB与SS—BM中CD4^＋、CD8^＋初始和记忆T细胞的比例组成，并计算每微升采集物中各细胞亚群的绝对数量。结果表明：G—PB中CD4^＋、CD8^＋T细胞的比例组成及CD4^＋／CD8^＋比值均高于SS—BM（P〈0．05）；G—PB中CD4^＋初始T细胞的比例显著低于SS—BM（P〈0．001），而CD4^＋TEM比例显著高于SS—BM（P〈0．001）；G—PB中CD8^＋初始和记忆T细胞亚群的比例与SS—BM无显著差异（P〉0．05）；与SS—BM相比，G—PB中CD4^＋CD62L^＋T细胞的比例明显降低（P=0．001），每微升G—PB移植物中的各淋巴细胞亚群均明显高于SS—BM（P〈0.001）。结论：G—PB与SS—BM中CD4^＋、CD8^＋初始和记忆T细胞亚群在相对和绝对数量方面存在明显的差异，这种差异可能影响G—PB和SS—BM移植后急性、慢性移植物抗宿主病发生率及其程度的异同。     

rhG-CSF对骨髓采集物中记忆T细胞上黏附分子表达的调节作用

本研究主要探讨人重组粒细胞集落刺激因子（rhG—CSF）对骨髓采集物记忆T细胞上黏附分子表达的调节作用。采用流式细胞仪检测稳态骨髓（SS—BM）和rhG—CSF预激的骨髓（G—BM）中CD4^＋、CD8^＋T细胞百分比及其记忆细胞表面黏附分子CD49d、CD54、CD62L和CD11a的表达。结果显示：rhG—CSF应用后骨髓采集物中CD4^＋、CD8^＋T细胞在淋巴细胞中的比例明显降低（P〈0．001）,记忆T细胞的比例没有明显变化;CD49d在CD4^＋和CD8^＋T细胞的表达百分比显著下降（p〈0．05）,但在记忆T细胞的表达百分比没有明显的变化;CD54在CD4^＋及其记忆T淋巴细胞和CD8^＋T淋巴细胞的表达百分比明显降低（P〈0．05）,而在CD8^＋记忆T细胞的表达百分比没有明显变化;CD62L在CD4^＋、CD8^＋及其记忆T细胞的表达百分比显著下降（P〈0．01）;CD11a在CD4^＋及其记忆T细胞的表达百分比明显降低（p〈0．05）,而在CD8^＋及其记忆T细胞的表达百分比没有明显变化。结论：rhG—CSF部分下调骨髓中CD4^＋、CD8^＋以及相应的记忆T细胞上黏附分子表达。     

不同来源人造血干/祖细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢能力的差异

目的 比较不同来源的人造血干／祖细胞在NOD／SCID小鼠体内归巢能力的差异性，并探讨其体内归巢能力与膜表面归巢相关分子CXCR4表达水平的相关性。方法 采用流式细胞术（FACS）检测新鲜脐血、冻存脐血、动员后外周血（mPB）及骨髓来源的CD34^＋细胞表面CXCR4表达水平；将荧光染料CFSE标记的人CD34^＋细胞移植人接受照射的NOD／SCID小鼠，移植后20小时检测已归巢于NOD／SCID小鼠骨髓及脾脏中不同来源的人CD34^＋细胞，计算其相应的骨髓及脾脏归巢效率；并将小鼠股骨制成组织切片，荧光显微镜下观察人CD34^＋细胞在小鼠骨髓腔内的分布。结果 新鲜脐血、冻存脐血、mPB和骨髓CD34^＋细胞膜表面CXCR4表达阳性率分别为（49.52±1．12）％。（46．12±2．29）％，（48．50±2．48）％和（65．39±1．27）％，CD34^＋细胞在NOD／SCID小鼠骨髓的归巢效率分别为（3．00±0．44）％，（2．84±0．46）％，（4．06±0．70）％及（5．76±0．52）％；在脾脏的归巢率分别为（1．88±0．12）％，（1．80±0．15）％，（1．90±0．22）％，（2．16±0．34）％。归巢的CD34^＋细胞主要分布于小鼠股骨的骨内膜区域。结论 脐血CD34^＋细胞膜表面CXCR4水平低于mPB和骨髓。经冻存复苏后脐血CD34^＋细胞膜表面CXCR4水平略有下调。脐血CD34^＋细胞在照射NOD／SCID小鼠的骨髓归巢效率低于mPB和骨髓。     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

人重组粒细胞集落刺激因子动员后采集骨髓对健康供者外周血采集物成份的影响

本研究探讨健康供者体内应用人重组粒细胞集落刺激因子（G—CSF）后采集骨髓对外周血采集物成份的影响。62例健康供者皮下注射rhG—CSF5μg/（kg·d），连用5天，其中31例供者在第4、5天分别采集骨髓和外周血采集物（A组）；另31例供者于第4、5天均单采集外周血单个核细胞（B组）。应用流式细胞术检测两组供者外周血采集物中的淋巴细胞、CD3^＋、CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD8^＋、CD14^＋、CD34^＋细胞以及CD3^＋CD4^-CD8^-T细胞的数量。结果显示，A组供者每微升外周血采集物中单个核细胞中CD3^＋、CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD8^＋、CD14^＋、CD34^＋细胞以及CD3^＋CD4^-CD8^-T细胞的中位含量分别1．56×10^5μ1、8．56×10^4μl、6．12×10^4μl、3．38×10^4μl、2．27×10^4μl、3．83×10^4μl、744μl及3588μl，与B组的1．40×10^5μl、7．34×10^4μ1、5．32×10^4l、3．06×10^4μl、1．83×10^4μl、3．21×10^4μl、554μl及3120μl的差异无统计学意义（p〉0．05）；A组外周血采集物中CD4^＋细胞与CD8^＋细胞的比值[1．52（0．54—2．87）]、单核细胞与CD3^＋细胞的比值[0．57（0．15—1．64）]以及CD3^＋CD4^-CD8^-T细胞与CD3^＋细胞[0．064（0．018—0．673）]的比值与B组[1．68（0．31—3．35）]、[0．59（0．18—1．25）]、[0．063（0．021—0．136）]的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论：健康供者体内应用rhG—CSF后采集骨髓对外周血采集物成份无影响，对rhG—CSF动员的同一健康供者可单独采集骨髓、外周血采集物或同时采集两种采集物以满足临床移植的需要。     

正常人骨髓、脐血及动员后外周血CD^＋34细胞粘附分子的研究

目的探讨正常人骨髓、脐血及动员后外周血CD34+细胞粘附分子的表达及外周血干细胞动员的可能机制.方法采用CD34+MultiSortKit免疫磁珠分离系统,分离纯化出正常人骨髓、脐血及动员后外周血CD34+细胞,流式细胞术检测其纯度,选择与CD34+细胞相关的粘附分子CD44、CD11a、CD18、CD49d、CD54、CD58及CD62L,进行免疫荧光标记及短期液体培养后再行免疫荧光标记,流式细胞术检测.结果动员后外周血CD34+细胞粘附分子表达CD44为(92.7±2.2)%[骨髓(93.1±2.3)%]、CD11a为(56.3±6.0)%[骨髓(61.8±7.8)%]、CD18为(65.2±6.0)%[骨髓(70.6±7.5)%]、CD49d为(39.4±7.2)%[骨髓(66.9±5.1)%]、CD54为(20.9±4.1)%[骨髓(24.1±3.8)%]、CD58为(77.9±5.8)%[骨髓(81.9±5.6)%]及CD62L为(45.9±5.6)%[骨髓(63.9±4.3)%],其表达均较骨髓为低,尤以CD49d和CD62L为著.脐血CD34+细胞CD11a为(55.5±6.5)%、CD18为(66.7±7.5)%、CD44为(90.3±4.0)%、CD49d为(63.7±6.7)%、CD62L为(50.8±5.9)%,其表达亦较骨髓为低,尤以CD62L为著,但脐血CD54的表达[(29.1±4.9)%]较骨髓及动员后外周血为高,尤较动员后外周血为著.结论不同来源CD34+细胞粘附分子表达存在差异,外周血细胞动员的机制可能与粘附分子的表达下调有关.     

G-CSF对供者外周血CD34+细胞黏附分子表达的影响

目的通过观察健康供者外周血CD34+细胞黏附分子表达的变化,探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的机制及其对供者的影响。方法应用流式细胞仪分析15名健康供者在接受G-CSF10μg.kg-1.d-1动员前(Pre-G)、动员d4和停止动员后7d(Pro-G)外周血CD34+细胞比例及其表面黏附分子非常延迟抗原-5(VLA-5,CD49e)和L-选择素(CD62L)的表达情况。结果G-CSF动员后供者外周血CD34+细胞比例较动员前增高5-10倍,停止动员后恢复至动员前水平。G-CSF动员后CD34+CD49e+细胞比例(97.74%)明显高于动员前(79.95%),停止动员后7d CD34+CD49e+细胞比例基本恢复至动员前水平;CD34+CD62L+细胞比例在G-CSF动员过程中无明显改变;CD34+细胞表面CD49e与CD62L的平均荧光强度于动员后呈减弱趋势,但无显著统计学意义。结论G-CSF动员后d4可显著增加供者外周血CD34+细胞比例,可致CD34+CD49e+细胞比例一过性增加,但不影响CD34+CD62L+细胞群的比例。     

rhG-CSF体内应用对骨髓和外周血造血干/祖细胞上CXCR-4表达的影响

为了观察rhG-CSF动员对外周血和骨髓造血干/祖细胞上CXCR-4表达的影响,应用三色荧光标记技术对动员前后骨髓和外周血中单个核细胞（MNC）和CD34＋细胞上CXCR-4的表达进行了测定.结果显示,G-CSF动员显著增加了外周血MNC及骨髓CD34＋细胞上CXCR-4的表达,骨髓MNC及外周血CD34＋细胞上CXCR-4的表达无变化,稳态骨髓（SS-BM）中CD34＋细胞比例与G-BM、G-PB中CD34＋细胞比例呈正相关,与采集到的骨髓及外周血中CD34＋细胞/公斤也具有良好的正相关性.结论：G-CSF体内应用后CD34＋细胞上CXCR-4表达的变化可能是动员机制的一部分,CXCR-4的高表达可能有利于MNC的植入,SS-BM中CD34＋细胞的含量可作为动员效果好坏的预测指标.     

CD34+ cells and CD34+CD38- subset from mobilized blood show different patterns of adhesion molecules compared to those from steady-state blood, bone marrow, and cord blood

As suggested previously, a down-regulation of some cellular adhesion molecules (CAMs) on CD34(+) hematopoietic progenitor cells (HPC) may contribute to their egress from bone marrow (BM) to peripheral blood (PB) by decreasing their adhesion to BM stromal cells. Besides counting the percentage of CAM-positive cells, we decided to define clearly the antigen density (AgD) of the CAM on mobilized- and steady-state CD34(+) HPC using QIFIKIT calibration beads. Five sources of cells were compared: PB and BM from normal donors (nPB, nBM) cord blood (CB), mobilized PB obtained from leukapheresis products (LKP), and mobilized BM (mBM) samples. In our study the CAM-AgD was the lowest on CD34(+) cells in LKP which, on the contrary, contained the highest percentage of CD117(+), CD54(+), CD58(+) cell subsets. As for CB, a greater proportion of CD44(+) and CD62L(+) cells was observed in LKP than in other products. The LKP-CD34(+) cell population contained a greater percentage of CD11a(+) cells when compared to mBM, but the lowest percentage of CD49d(+) and CD49e(+) cells when compared to all products. The proportion of the CD34(+)CD38(-) immature subset expressing CD11a, CD44, CD54, or CD62L was greater in LKP than in mBM; the CD62L-AgD was higher in LKP than in mBM. This quantitative analysis clearly showed a downregulation of all CAM on LKP-CD34(+). The CD44, CD62L, CD11a, and CD54 AgD decrease appears to be specifically involved in the egress of the CD34(+) subsets into PB. The control of antigen density of these adhesion molecules is likely to be clinically important for effective mobilization of HPC as well as for rapid engraftment following HPC transplant.     

新型外周血CD34+细胞动员剂--抗CD49d单克隆抗体的实验研究

为了探讨外周血干细胞动员的新途径，用抗CD49d单克隆抗体和rhG-CSF及二者联合给小鼠皮下注射，动态观察小鼠外周血的白细胞总数和CD34^ 细胞数的变化，并将各种动员方法所获得的干细胞分别进行干细胞移植。结果发现，给予动员剂后小鼠的外周血白细胞总数和CD34^ 细胞比例明显升高，以rhG-CSF和抗CD49d单克隆抗体联合给药效果最佳。移植后各组小鼠均获造血重建，以联合动员组造血恢复速度最快。结论：抗CD49d单克隆抗体能有效动员小鼠外周血干细胞，与rhG-CSF具有协同作用。     

脐带间充质干细胞对CD34+细胞在小鼠体内归巢的影响及其机制研究

目的 探讨脐带来源间充质干细胞(MSC)对脐血来源CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢的影响及其可能的机制.方法 将CD34+细胞与MSC细胞共移植入经放射线照射后的NOD/SCID小鼠,采用流式细胞术和RT-PCR检测移植后20 h NOD/SCID小鼠骨髓及脾脏中人CD34+细胞,计算其相应的骨髓和脾脏的归巢效率.将脐血CD34+细胞与脐带MSC体外共培养,检测MSC细胞对CD34+细胞趋化功能的影响;并于培养4、7 d检测培养后CD34+细胞表面CD49e、CD31、CD62L、CD11a等归巢相关黏附分子表达情况.结果 ①移植后20 h采用流式细胞术成功在小鼠骨髓和脾脏中检测到人CD45+细胞.共移植组CD34+细胞骨髓归巢率[(7.2±1.1)%]高于单移植组[(5.4±0.9)%](P<0.05).②RT-PCR结果 显示共移植组小鼠骨髓细胞和脾脏细胞,单移植组小鼠脾脏细胞扩增得到人GAPDH基因片段,而单移植组小鼠骨髓细胞未见明显扩增条带.③MSC存在时,CD34+细胞的体外迁移能力为(35.7±5.8)%,显著高于CD34+细胞自发迁移率[(3.5±0.6)%,P<0.05].④CD34+细胞与MSC体外共培养后细胞表面CD49e、CD31和CD62L黏附分子的表达水平高于CD34+细胞单独培养组.结论 MSC细胞与CD34+细胞共移植有利于CD34+细胞向骨髓、脾脏等造血器官归巢,这可能与MSC促进CD34+细胞迁移以及维持CD34+细胞表面归巢相关黏附分子的表达相关.     

CD34+ cell adhesion molecule profiles differ between patients mobilized with granulocyte-colony-stimulating factor alone and chemotherapy followed by granulocyte-colony-stimulating factor

BACKGROUND: High-dose therapy with autologous peripheral blood progenitor cell support is widely utilized but requires successful CD34+ cell mobilization and collection. Chemotherapy plus growth factors appear to mobilize more CD34+ cells than growth factors alone. Because alterations in expression of adhesion molecules are important in the trafficking of hematopoietic progenitors, the possibility was explored that the mechanism of this superior mobilization may be greater down regulation of adhesion molecules. STUDY DESIGN AND METHODS: The expression of eight adhesion molecules (CD11a, b, and c; 15s; 49d and e; 54; and 62L) on the collected CD34+ cells from 15 patients undergoing mobilization with chemotherapy plus granulocyte-colony-stimulating factor (G-CSF) was compared with those of 14 concomitant patients receiving G-CSF alone. RESULTS: Patients receiving chemotherapy plus G-CSF mobilized more CD34+ cells and did not differ in prior chemotherapy or radiation. There were no significant differences in the percentage of CD34+ cells expressing any of the adhesion molecules examined between the two groups. The chemotherapy plus G-CSF-mobilized cells consistently showed higher expression intensity, and this showed significance or a strong trend for CD11a and c, CD15s, and CD54. Despite these higher expression levels, there were no differences in engraftment kinetics. CONCLUSIONS: CD34+ cells mobilized by chemotherapy plus growth factors appear to have higher intensities of expression of several adhesion molecules. The significance of this observation will require further study.