硼替佐米联合毛喉素诱导硼替佐米耐药骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

背景与目的：硼替佐米作为蛋白酶体抑制剂已成为新诊断和复发多发性骨髓瘤患者临床治疗的主要药物,但仍有部分患者对硼替佐米产生耐药而影响其长期生存。近年来研究发现,提高细胞内环腺苷酸浓度可以诱导骨髓瘤细胞凋亡并延缓其生长,成为骨髓瘤治疗新途径。该研究通过观察硼替佐米联合腺苷酸环化酶激动剂毛喉素(forskolin)对硼替佐米耐药骨髓瘤细胞的作用,探究克服骨髓瘤耐药的可能途径及其机制。方法：以硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株H929-R和原代细胞为模型,通过观察细胞生长、形态、凋亡相关基因的改变来研究硼替佐米、毛喉素单独或联合处理对硼替佐米耐药细胞增殖及凋亡的影响;并应用Rh123/PI双染法检测药物处理前后细胞内线粒体跨膜电位的变化;同时采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time lfuorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)检测线粒体凋亡相关基因转录水平及抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的蛋白水平的改变。结果：硼替佐米(20 nmol/L)与毛喉素(50 nmol/L)能够协同诱导硼替佐米耐药细胞凋亡。进一步研究发现,毛喉素可协同硼替佐米促使耐药细胞内线粒体跨膜电位下降并下调其Bcl-2和Mcl-1蛋白的表达。结论：毛喉素联合硼替佐米能够诱导硼替佐米耐药骨髓瘤细胞凋亡。     

脉冲磁场对高三尖杉酯碱诱导白血病细胞凋亡的影响

目的观察脉冲磁场(PMF)对高三尖杉酯碱(HHT)诱导白血病细胞凋亡的影响.方法以人早幼粒白血病细胞(HL-60)为实验对象,采用细胞计数、细胞形态学及流式细胞仪进行分析.结果HHT可诱导HL-60细胞凋亡,PMF能明显增加HHT诱导HL-60细胞凋亡.结论PMF通过对HL-60细胞周期的影响促进HL-60细胞凋亡从而增加对化疗药物的敏感性,表明PMF对治疗白血病具有潜在的应用价值.     

苦参碱联合高三尖杉酯碱抑制急性髓系白血病HL-60细胞增殖的研究

目的 探讨苦参碱(MAT)联合高三尖杉酯碱(HHT)对人急性髓系白血病(AML)HL-60细胞增殖的抑制作用,寻找经济有效的抗白血病中药.方法 应用CCK8法检测HHT、MAT单药对HL-60细胞的增殖抑制情况,以低于50％抑制浓度(IC50)的HHT与低于10％抑制浓度(IC10)的MAT联合用药,检测联合用药对HL-60细胞的增殖抑制情况.结果 HHT、MAT单独用药时,随着药物浓度增加,对HL-60细胞增殖抑制作用逐渐增强,与剂量呈依赖关系,与对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.01).HHT、MAT对HL-60细胞IC50分别为0.042、780 mg/L.MAT对HL-60细胞IC10是32 mg/L,与各相应浓度HHT单独用药比较,不同浓度(0.002 5、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.040 0 mg/L)HHT与MAT(25 mg/L)分别联合用药对HL-60细胞增殖的抑制率均升高,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 中药提取物HHT、MAT有抑制HL-60细胞增殖作用,联合用药能增强抑制作用.     

硼替佐米调控内质网应激诱导人急性T淋巴细胞白血病细胞株凋亡的机制探讨

目的:探讨硼替佐米对人急性T淋巴细胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）细胞株Molt-4细胞凋亡的影响。方法:硼替佐米（0、100、200和400 nmol/L）处理人急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞后，运用MTT法测定Molt-4细胞活力；使用Hoechst 33258染色法观察凋亡细胞形态；采用荧光定量PCR法测定Bax以及Bip mRNA水平；运用Western blot法测定Bax以及Bip蛋白水平。结果:100、200和400 nmol/L的硼替佐米处理Molt-4细胞24 h后，可浓度依赖性地降低细胞活力。100、200和400 nmol/L的硼替佐米作用细胞24 h后，Molt-4细胞核发生固缩或裂解。硼替佐米（100、200和400 nmol/L）处理细胞24 h后，Molt-4细胞的Bax mRNA和蛋白表达水平明显增加且可显著上调Bip mRNA和蛋白表达水平。结论:硼替佐米可诱导人急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞凋亡，作用机制可能与它调控内质网应激有关。     

高三尖杉酯碱诱导急性白血病原代细胞凋亡的观察

目的　观察高三尖杉酯碱 (HHar)诱导急性白血病 (AL)原代细胞凋亡的形态、生化特征 ,并分析量效关系 ,以指导临床治疗。方法　经 HHar作用后的 AL 原代细胞由光镜、电镜观察形态特征 ,DNA凝胶电泳、二苯胺法测定生化特征 ,SSPS软件分析量效关系。结果　 HHar作用后 AL原代细胞形态、生化特征均符合典型的细胞凋亡改变 ;其DNA片段化率随 HHar作用时间的延长 ,浓度的增高而增加 ,具有时间——效应及剂量——效应线性趋势。DNA片段化率与坏死率正相关。结论　 HHar确可诱导 AL 原代细胞凋亡。其诱导细胞凋亡的能力因剂量、作用时间的不同而不同     

环孢霉素A增强羟基喜树碱、三尖杉酯碱对HL-60细胞凋亡的诱导

目的:观察环孢霉素A(CsA)对羟基喜树碱(HCPT)、三尖杉酯碱(HT)诱导白血病细胞凋亡的调节作用.方法:应用细胞形态学检查,DNA凝胶电泳及流式细胞术分析检测.结果:CsA3μg/ml对HL-60细胞生长无明显影响,也没有促进凋亡作用.HL-60细胞加上HCPT0.5μg/ml、HT0.1μg/ml作用4h,细胞凋亡率分别为(35.7±1.3)%和(31.9±0.8)%.先以CsA3μg/ml作用HL-60细胞24h,洗涤,然后再加HCPT0.5μg/ml、HT0.1μg/ml继续作用4h,细胞凋亡率明显增加,达(47.5±0.5)%(P<0.01)和(44.3±0.8)%(P<0.01).CsA+HCPT及CsA+HT组分别比单独HCPT、HT组诱导的DNA梯状条带亮度增强.CsA3μg/ml对HL-60细胞的bcl-2蛋白表达以及周期分布均无影响.结论:CsA能提高HL-60细胞对HCPT或HT诱导凋亡敏感性.提示临床上应用CsA联合HCPT或HT治疗白血病,可能取得较好疗效.     

高三尖杉酯碱治疗急性白血病机制的研究

目的：探讨高三尖杉酯碱(HHar)对AML的疗效明显优于ALL的可能机制。方法：以成人AL原代细胞为研究对象，利用其遗传性和体内细胞相似的特点，模拟人体用药后的最大血药浓度，采用高、中、低3种浓度梯度对HHar进行研究。采用光镜、扫描电镜、透射电镜、DNA凝胶电泳、二苯胺法、流式细胞术等方法，充分证实HHar确可诱导AL原代细胞凋亡。并进一步选取其中较为经济的光镜下计数细胞凋亡率、二苯胺法定量测定凋亡细胞的DNA片段化率及锥虫蓝染色光镜下计数坏死率3种方法定量观察HHar对ALL及AML原代细胞的诱导凋亡和杀伤，得出相应的时间—剂量—效应关系，并进行对比分析。结果：HHar可诱导AL原代细胞凋亡，AML原代细胞对HHar诱导凋亡的敏感性高于ALL原代细胞。结论：AML原代细胞对HHar诱导凋亡的敏感性高于ALL原代细胞，这是其临床疗效优于ALL的可能机制。     

硼替佐米联合阿霉素诱导T细胞淋巴瘤细胞凋亡的实验研究

目的 探讨蛋白酶抑制剂硼替佐米对淋巴瘤细胞株Jurkat细胞的凋亡诱导作用及其可能机制,同时观察联合硼替佐米与阿霉素对Jurkat细胞有无协同作用.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测硼替佐米、阿霉素对Jurkat细胞体外生长的抑制作用,油镜下观察细胞形态变化.采用DNA的碘化丙啶(PI)染色及Annexin V-PI双标记法检测细胞凋亡率,Western blot法检测硼替佐米、阿霉素对Jurkat细胞caspase-3、caspase-8和聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)蛋白表达水平的影响.结果 10～320 ng/ml硼替佐米处理Jurkat细胞24、48和72 h,均能明显抑制细胞增殖,且生长抑制率与药物作用浓度呈正相关,硼替佐米作用24、48和72 h的相关系数分别为0.900、0.849和0.679(均P<0.01),呈浓度依赖性.以10～320 ng/ml硼替佐米单药或联合低剂量阿霉素(125ng/ml)处理Jurkat细胞24 h,硼替佐米的IC_(50)从(137.64±6.82)ng/ml降为(20.44±2.85)ng/ml.细胞凋亡率与硼替佐米的作用浓度呈正相关(P<0.01).硼替佐米作用Jurkat细胞后,caspase-3、caspase-8和PARP蛋白均出现明显的剪切带.结论 硼替佐米具有诱导Jurkat细胞凋亡的作用,通过外源性途径诱导凋亡是其机制之一.硼替佐米与阿霉素有一定的协同作用,二者联合能增强Jurkat细胞对硼替佐米的敏感性.     

高三尖杉酯碱诱导急性白血病原代细胞凋亡和杀伤作用的研究

目的　探讨高三尖杉酯碱 (HHar)对AML的疗效明显优于ALL的可能机制。方法　以成人AL原代细胞为研究对象 ,采用高、中、低三种浓度梯度对HHar进行研究。采用光镜、扫描电镜下观察细胞凋亡的形态变化 ,透射电镜下观察细胞超微结构改变 ,DNA凝胶电泳、二苯胺法、流式细胞术等方法 ,证实HHar确可诱导AL原代细胞凋亡。尔后采用光镜计数细胞凋亡率、二苯胺定量测定凋亡细胞的DNA片段化率及台盼蓝染色光镜下计数坏死率三种方法来观察HHar对ALL及AML原代细胞的诱导凋亡和杀伤 ,得出相应的时间、剂量、效应关系 ,并进行对比分析。结果　HHar对AML原代细胞诱导凋亡的敏感性高于ALL原代细胞。结论　Hhar对AML原代细胞诱导凋亡的敏感性高是其临床疗效优于ALL的可能机制     

高三尖杉酯碱诱导急性白血病原代细胞凋亡和杀伤作用的研究

目的：探讨高三尖杉酯碱（HHar）对AML的疗效明显优于ALL的可能机制。方法：以成人AL原代细胞为研究对象，采用高、中、低三种浓度梯度对HHar进行研究。采用光镜、扫描电镜下观察细胞凋亡的形态变化，透射电镜下观察细胞超微结构改变，DNA凝胶电泳、二苯胺法、流式细胞术等方法，证实HHar确可诱导AL原代细胞凋亡。尔后采用光镜计数细胞凋亡率、二苯胺定量测定凋亡细胞的DNA片段化率及台盼蓝当然光镜下计数坏死率三种方法来观察HHar对ALL及AML原代细胞的诱导凋亡和杀伤，得出相应的时间、剂量、效应关系，并进行对比分析。结果：HHar对AML原代细胞诱导凋亡的敏感性高于ALL原代细胞。结论：Hhar对AML原代细胞诱导凋亡的敏感性高是其临床疗效优于ALL的可能机制。     

硼替佐米对白血病细胞株HEL抑制作用的初步探讨

 目的　探讨硼替佐米单独或联合化疗药物对急性白血病细胞株HEL生长的影响及其机制。方法　MTT法检测药物对HEL的生长抑制效应,流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡,Western blotting检测凋亡及细胞周期相关蛋白表达。结果　硼替佐米对HEL细胞的生长抑制作用呈浓度依赖关系,其半数抑制浓度（IC50）为7.15 nmol／L;硼替佐米联合化疗药物明显增强抑制HEL细胞生长;流式细胞术检测可见时间依赖性的G2／M周期阻滞;Western blotting检测显示bcl-2表达下降,bax、p27表达增高,联合用药时具有相加效应,但不管是单独或联合用药,p53蛋白的表达均无明显改变。结论　硼替佐米可能是一种有效治疗急性白血病的药物,与柔红霉素联合应用有更强的抑制肿瘤细胞生长和诱导其凋亡的作用,其机制可能与bcl-2,bax及p27蛋白的调节有关,是非p53依赖性的。     

siRNA-2提高HL-60细胞对高三尖杉酯碱敏感性的实验研究

 目的 研究以bcl-2基因为靶标的有效siRNA对HL-60细胞高三尖杉酯碱（HT）药物敏感性的影响。方法 通过脂质体将siRNA转入HL-60细胞株并与HT联合培养，于24，48，72 h，用MTT法检测对细胞生长的抑制，用流式细胞仪检测HL-60细胞bcl-2蛋白的表达率，细胞内活性氧（ROS）水平变化及细胞线粒体膜电位的变化。结果 siRNA明显提高HT对HL-60细胞的生长抑制效应；抑制细胞bcl-2蛋白的表达，提高细胞内ROS水平，降低线粒体膜电位（P＜0.05）。结论 以bcl-2基因为靶标的siRNA能提高白血病细胞HL-60对HT敏感性。     

HL-60细胞高三尖杉酯碱诱导后CD44表达变化及机制的研究

目的:研究高三尖杉酯碱(homohar-ringtonine,HHT)诱导HL-60细胞分化后CD44表达变化及其与细胞周期调控的关系,探讨HHT的作用机制。方法:建立HHT诱导分化模型,瑞氏染色观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖变化,NBT还原实验测定细胞分化状态,流式细胞术检测细胞表面CD11b表达及细胞周期变化,RT-PCR检测CD44、p27、p21和Cyclin E基因在mRNA水平的表达变化。结果:MTT实验显示,HHT对HL-60细胞产生增殖抑制作用,HL-60细胞G0/G1期细胞百分比明显上升,S期细胞百分比明显下降,P<0.05。半定量分析PCR扩增产物光密度相对表达量显示,HHT诱导后HL-60细胞中CD44基因表达逐渐减弱,p27和p21基因逐渐增强,Cyclin E基因逐渐减弱。CD44与p27表达呈明显负相关,r=-0.686,P<0.05。结论:HHT可能通过下调CD44基因,进而提高p27和p21表达,抑制Cyclin E活性而对HL60细胞产生诱导分化作用。     

硼替佐米增加耐药白血病细胞株K562/DNR对化疗药物的敏感性

目的:观察蛋白酶体抑制剂硼替佐米是否可以增加耐药白血病细胞株K562/DNR对化疗药物的敏感性.方法:MTT法计算硼替佐米逆转耐药倍数,流式细胞术(FCM)检测细胞调亡比及细胞内药物浓度.结果:表柔比星单独及联合硼替佐米作用于K562/DNR细胞株的IC50分别为417.0μg/ml和210.4 μg/ml,逆转倍数为1.98倍;柔红霉素单独及联合硼替佐米作用于K 562/DNR细胞株的IC50分别为457.7μg/ml和324.9 μg/ml,逆转倍数为1.4倍.单独应用表柔比星组细胞调亡比为(28.74±4.6)％,联合硼替佐米组细胞调亡比为(39.14±9.6)％.硼替佐米能使K562/DNR细胞内柔红霉素含量增加,而对K562/S细胞无类似影响.结论:蛋白酶体抑制剂硼替佐米能增加耐药白血病细胞株K562/ DNR的化疗药物的敏感性,逆转耐药性.     

ALA-PDT诱导白血病细胞株HL-60凋亡

背景与目的:基于5-氨基乙酰丙酸的光动力疗法(ALA-PDT)利用肿瘤细胞对ALA产生的内源性光敏剂原卟啉IX(PpIX)的优先摄取,使肿瘤细胞在受到一定的光照后被选择性地杀伤。到目前为止,ALA-PDT引起肿瘤细胞破坏的确切机制尚未完全阐明。本研究探讨ALA-PDT对白血病细胞株HL-60的凋亡诱导作用。方法:以白血病细胞株HL-60为实验模型。实验分为4组,对照组、单纯ALA组、单纯光照组及ALA PDT组。用MTT法检测细胞的存活率,瑞氏染色观察细胞形态学改变,用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,并用共聚焦激光显微镜(LSCM)观察凋亡细胞的特征。结果:ALA PDT组光照后细胞形态学可见凋亡改变;MTT法显示细胞存活率明显下降,24 h为(46±9)%,48 h为(26±8)%,两者比较差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测显示光照后4、5和24 h细胞凋亡率分别为(26±9)%、(29±11)%和(51±6)%,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);LSCM观察AnnexinV-FITC单阳性及AnnexinV-FITC/PI双阳性细胞均具有典型的凋亡特征,而单纯ALA组、单纯光照组及对照组则无上述改变。结论:ALA-PDT能杀伤白血病细胞株HL-60,主要通过诱导凋亡的方式实现的,并呈一定的时间依赖性。     

硼替佐米对老年白血病患者原代细胞增殖、凋亡及其bcl-2家族蛋白表达的影响

 目的 研究硼替佐米对老年白血病原代细胞增殖、凋亡及其bcl-2家族蛋白表达的影响。方法 MTT比色法检测细胞增殖活力;荧光显微镜形态观察、流式细胞仪检测细胞凋亡;Western-blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 50～5000nM硼替佐米均可抑制细胞增殖并诱导凋亡,其中50nM和5000nM处理细胞24h,细胞增殖活力分别下降至90%和70%,细胞凋亡率分别为10.2±2.3%和13.3±3.3%;延长处理时间至48h,细胞活力进一步下降至86%和60%,细胞凋亡率增至18.4±3.9%和20.7±3.7%,与对照组相比差异均具有统计学意义（P值均<0.05）;50～5000nM硼替佐米处理细胞24-48h,Bcl-2蛋白表达逐渐下降,Bax蛋白表达逐渐增加。结论 硼替佐米对老年白血病原代细胞具有抑制增殖、诱导凋亡作用,其作用机制可能与Bcl-2家族蛋白的表达水平变化相关。     

硼替佐米联合化疗治疗浆细胞白血病的疗效观察

目的评估硼替佐米联合化疗治疗浆细胞白血病(plasma cell leukemia,PCL)的疗效和不良反应。方法 11例浆细胞白血病经骨髓穿刺确诊,给予含硼替佐米方案化疗。硼替佐米给药方案为1.3 mg/m~2,d1,d4,d8,d11;联合的化疗方案包括地塞米松(BD),吡柔比星加地塞米松(PAD),马法兰加泼尼松(VMP)等。按照国际骨髓瘤工作组制定的疗效标准评估疗效,按照NCI标准评估不良反应。结果 11例患者共完成37个治疗周期,平均每例3.4个周期。11例患者中,2例获得CR,6例获得VGPR,1例获得PR,总反应率达81.8%。中位生存期17.2个月,与历史数据相比有明显区别(17.2个月vs 5.6个月).不良反应主要是骨髓抑制和感染。结论硼替佐米联合化疗治疗浆细胞白血病的疗效确切,不良反应可耐受。     

硼替佐米治疗肝细胞癌的分子机制

0 引言 肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是我国一种常见的消化道恶性肿瘤,其占原发性肝癌的90%,发病率仅次于胃癌和食管癌.目前治疗首选方法是手术切除,但术后的复发和转移率高,特别是肝内复发率高是制约肝癌疗效进一步提高的最重要因素之一.HCC对放疗并不敏感,对化疗的反应性也欠佳,其对化疗药物容易产生多药耐性(Multidrug resistance,MDR)而降低治疗效果[1-2].因此寻求新型的HCC分子靶向治疗药物成为当务之急.     

硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖和凋亡影响的研究

目的 探讨硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖和凋亡的影响.方法 采用20、40、60、80和100 nmol/L的硼替佐米处理骨髓瘤细胞株RPMI8226(处理组),以不含硼替佐米的细胞作为对照(对照组).采用MTT法检测硼替佐米对RPMI8226细胞的增殖抑制作用,采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,采用RT-PCR和Western Blot技术检测细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、c-myc及PI3K/AKT信号通路相关蛋白Bcl-2、Bax的mRNA和蛋白表达水平.结果 不同浓度的硼替佐米均可抑制RPMI8226细胞的增殖,且呈剂量效应;20、40、60、80和100 nmol/L硼替佐米处理组的RPMI8226细胞凋亡率分别为(11.80±0.56)%、(19.45±1.25)%、(36.82±2.26)%、(43.56±3.50)%和(56.62±5.02)%,均高于对照组的(8.02±0.45)%,差异均有统计学意义(P﹤0.05).处理组c-myc、β-catenin及Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均低于对照组,且随硼替佐米浓度的增加而下降;而Bax的mRNA和蛋白表达水平均高于对照组,且随硼替佐米浓度的增加而升高.结论 硼替佐米可抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖,促进其凋亡,作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路和PI3K/AKT信号通路有关.