不同浓度葡萄糖对大鼠骨髓破骨细胞分化的影响

目的观察不同浓度葡萄糖对大鼠骨髓破骨细胞（Osteoclasts OC）分化的影响，探讨糖尿病骨质疏松的发病机制。方法用M—CSF、RANKL诱导大鼠骨髓单个核细胞分化为OC，同时给予不同浓度的葡萄糖（0、5．5、15、25mmol／L）干预，通过观察抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色阳性OC数、TRAP活性测定、OC膜表面RANK mRNA表达量来分析葡萄糖对破骨细胞分化的影响。结果①高浓度葡萄糖组（25mmol/L）培养7d时TRAP染色阳性OC数及TRAP活性测定均高于对照（0mmol／L）组、葡萄糖5．5mmol／L组（P〈0．01）；与对照组比较高浓度葡萄糖组培养3d时TRAP染色阳性OC数明显增多（P〈0．01）。②葡萄糖呈浓度依赖性上调OC膜表面RANK mRNA的表达，其中高浓度葡萄糖组培养的各时间点与其他3组比较差异有统计学意义（P〈0．01，P〈0．05）。结论①高浓度葡萄糖可促进破骨细胞的分化，其促进作用始于诱导分化的早期。②骨髓微环境中高浓度葡萄糖可引起OC分化增多，可能是糖尿病骨质疏松的发病机制之一。     

破骨细胞分化调节机制的研究进展

破骨细胞起源于骨髓的单核髓性造血干细胞, 是一种具有骨吸收功能的多核巨细胞, 其在骨代谢方面起着关键性的作用, 因而机体对于破骨细胞的调控非常严格。破骨细胞动员和分化成熟过程是一个复杂而又精细的多级调控过程, 在相关调控机制中, OPG/RANKL/RANK系统起着分化调节枢纽的作用, 是调节破骨细胞分化和功能的关键信号途径。最近研究发现破骨细胞和免疫细胞在骨代谢领域相互联系紧密, 这也为骨疾病的治疗提供了新的治疗靶点。另外破骨细胞凋亡在骨代谢中的作用越来越受重视, 但其相关机制还不是很明确, 仍需要深入研究。     

破骨前体细胞异质性与破骨细胞分化之间的联系

破骨细胞是一种在体内主要发挥溶骨作用的细胞,其由破骨前体细胞融合形成多核巨细胞。近来,活细胞成像技术显示破骨细胞多核化过程具有异质性改变。这种异质性不仅体现在破骨细胞表面分子、蛋白表达等细胞水平上存在差异,同时在体内迁移分布也有时间、空间的差别。而干扰破骨细胞异质性改变不仅能阻止破骨细胞融合,同时也可以抑制其功能。研究破骨细胞异质性体内体外表现,有助于提升对细胞融合的生理病理学理解,同时对抗骨吸收治疗及减少副作用起到一定作用。     

不同浓度白藜芦醇对破骨细胞分化的影响及自噬的作用

目的研究不同浓度白藜芦醇(RSV)对破骨细胞分化的影响及自噬在其中的作用。方法RANKL诱导RAW264.7细胞分化过程中,加入不同浓度(0、0.1、0.5、1、5及10μmol/L)RSV,CCK-8检测干预后12、24、48、72 h时的细胞活力;TRAP染色观察破骨细胞分化程度。加或不加入3-甲基嘌呤(3-MA)抑制自噬,RT-PCR检测破骨分化相关标志物TRAP、MMP-9、CTSK和自噬相关标志物LC3、Beclin-1、P62的mRNA表达情况;Western blot检测自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin-1、P62的表达情况。结果RANKL诱导分化过程中,细胞增殖活力提高,加入0.1~10μmol/L的RSV,细胞活力先上升后下降,在0.5μmol/L时达到最大;0.1μmol/L和0.5μmol/L的RSV能提高TRAP染色阳性的破骨细胞数和TRAP、MMP-9、CTSK、LC3、Beclin-1、P62的mRNA表达,自噬相关蛋白LC3II/I和Beclin-1也增加,P62的蛋白表达则减少;而1~10μmol/L RSV随浓度升高相关mRNA及蛋白LC3II/I和Beclin-1的表达减少,P62的蛋白表达增加;加入3-MA后,相关mRNA及蛋白LC3II/I和Beclin-1的表达减少,P62的蛋白表达增加。结论RSV浓度在0.1~10μmol/L范围内,破骨细胞分化和自噬水平先升高后降低,抑制自噬可以抑制破骨细胞的分化。白藜芦醇影响破骨细胞分化可能部分是通过调节自噬发挥作用。     

致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收的影响

目的研究致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响.方法从被骨水泥单体甲基丙烯酸甲酯(MMA)致敏的新西兰兔外周血中分离淋巴细胞并提取培养介质(LCM),分离培养兔颅骨成骨细胞和兔骨髓细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TrACP)染色和骨磨片扫描电镜观察对破骨细胞进行鉴定.在成骨细胞与骨髓细胞的培养体系中,分别在无LCM,未经MMA刺激的LCM和经MMA刺激的LCM等3种情况下,进行成熟破骨细胞计数和TrACP活性检测.结果骨髓细胞能够分化成破骨细胞并且能在骨磨片上形成骨吸收陷窝,致敏淋巴细胞培养介质能够明显促进破骨细胞数量的增加和TrACP的分泌,在加入MMA刺激后,这种作用更加显著.结论致敏淋巴细胞能够促进骨髓破骨细胞的分化和骨吸收能力.     

致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收的影响

目的；研究致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。方法：从被骨水泥单体甲基丙烯酸甲酯（MMA）致敏的新西兰兔外周血中分离淋巴细胞并提取培养介质（LCM），分离培养兔颅骨成骨细胞和兔骨髓细胞，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TrACP)染色和骨磨片扫描电镜观察对破骨细胞进行鉴定。在成骨细胞与骨髓细胞的培养体系中，分别在无LCM，未经MMA刺激的LCM和经MMA刺激的LCM等3种情况下，进行成熟破骨细胞计数和TrACP活性检测。结果：骨髓细胞能够分化成破骨细胞并且能在骨磨片上形成骨吸收陷窝，致敏淋巴细胞培养介质能够明显促进破骨细胞数量的增加和TrACP的分泌，在加入MMA刺激后，这种作用更加显著。结论：致敏淋巴细胞能够促进骨髓破骨细胞的分化和骨吸收能力。     

类黄酮对人体外周血破骨细胞分化p38MAPK/c-Fos信号通路调控的研究

目的探讨类黄酮调控p38MAPK/c-Fos信号通路对破骨细胞分化的影响。方法采用人体外周血分离单个核细胞,并诱导形成破骨细胞,干预组应用类黄酮对细胞进行处理,通过细胞形态学观察并检测细胞活性,再分别采用RT-PCR和Western blot两种方法观察p38MAPK通路及下游转录因子c-fos基因和蛋白的表达水平。结果对照组与干预组细胞形态学观察均可见诱导培养的破骨细胞形态明显;与对照组比较,干预组破骨细胞样细胞的形成减少,活性减弱,差异具有统计学意义(P0.05);RT-PCR结果显示,干预组p38MAPK通路下游转录因子c-fos表达水平较对照组下降,差异具有统计学意义(P0.01);Western blot检测结果显示,干预组c-fos蛋白表达水平较对照组降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论类黄酮在体外细胞培养中可抑制破骨细胞形态,并可通过下调p38MAPK通路中c-fos基因和蛋白水平的表达,从而减弱破骨细胞的吸收功能。     

盐酸二甲双胍抑制破骨细胞分化的研究

目的探讨盐酸二甲双胍对破骨细胞分化抑制作用的研究。方法核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞,在诱导过程中加入不同浓度的盐酸二甲双胍。培养7 d后固定,抗酒石酸酸性磷酸酶染色,计数破骨细胞的数量,骨吸收培养板观察骨陷窝面积,Western blot检测盐酸二甲双胍对ERK磷酸化的影响。结果盐酸二甲双胍能抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成,并且能减少骨陷窝面积,以及抑制ERK磷酸化。结论盐酸二甲双胍可抑制破骨细胞分化及功能,其机制可能与抑制ERK磷酸化有关。     

物理因素对破骨细胞分化及功能的影响

物理治疗学是医学物理学发展最快、在医学中应用最为广泛的领域之一,物理治疗正广泛应用于肿瘤、炎症、创伤等的治疗,其内容包括力学、热学、光学以及电磁学4方面。目前,物理治疗应用最多,研究最广泛的就是与破骨细胞（osteoclast,OC）相关的骨组织吸收、再生和改建方面。     

痩素对小鼠破骨细胞分化及功能的影响

目的 观察瘦素（leptin）对体外骨髓诱导培养的小鼠破骨细胞分化和功能的作用效应,探索leptin和骨吸收之间的关联.方法 建立由巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和骨保护素配体（RANKL）为共同细胞因子的小鼠破骨细胞骨髓诱导培养体系,将不同浓度的leptin作用于破骨细胞.实验中根据培养液中是否加入M-CSF和RANKL并依据leptin浓度的不同分为：A组,M-CSF和RANKL;B组,M-CSF、RANKL和leptin（80 ng/ml）;C组,M-CSF、RANKL和leptin（160 ng/ml）;D组,M-CSF、RANKL和leptin（240 ng/ml）;E组,M-CSF、RANKL和leptin（320 ng/ml）;F组,M-CSF、RANKL和leptin（400 ng/ml）;同时设立空白对照组G组.于作用后第7天取细胞玻片进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,观察破骨细胞并计数;于第10天取出骨片进行甲苯胺蓝染液染色,在光镜和扫描电镜观察骨吸收陷窝形态.结果：诱导培养的小鼠破骨细胞形态特征明显;A组在破骨细胞数量与D、E、F组相比较有明显的统计学差异（P＜0.05）;A组骨吸收面积比与B、C、D、E、F组都有明显的统计学差异（P＜0.05）.结论：leptin抑制体外培养的破骨细胞的分化和骨吸收功能.     

Effect of osteoprotegerin in combination with interleukin-6 on inhibition of osteoclast differentiation

Objective： To observe the effect of recombinant interleukin-6 （IL-6） and osteoprotegerin （OPG） on inhibiting bone absorption induced by receptor activa- tor for nuclear factor- rB ligand （RANKL） in murine osteo- clast precursor cells （OCPs） model. Methods： RAW 264.7 cells were solely treated with 50 ng/ml RANKL for 1 day, and then they were divided into three groups： RANKL （control group）, RANKL＋IL-6 （IL-6 group） and RANKL＋IL-6＋OPG （combination group）. These cells were harvested and investigated by means of HE stain- ing under light microscope after consecutive 9 days. Furthermore, staining tartrate-resistant acid phosphatase （TRAP）-positive multinucleated cells were detected by in- verted phase contrast microscope. The absorption pits of bone slices were observed under scanning electron microscope. Results： The number of mature osteoclast cells in control group was more than that in IL-6 alone or IL-6 com- bined with OPG group （P〈0.05）. Interestingly, this experi- ment has also demonstrated that there was a large number of TRAP-positive multinucleated osteoclasts （more than 3 nuclei） and several bone absorption formation in the con- trol group, whereas the outcome was completely different in both IL-6 group and IL-6＋OPG group （P〈0.05）. Conclusion： IL-6 can suppress the differentiation of mature osteoclasts as directly adding it into the RAW 264.7 cells induced by 50 ng/ml RANKL, and further the effect of osteolysis is remarkably reduced. When treatment with IL- 6 combined with OPG, a more effective strategy for the treat- ment of osteoporosis is reached.     

骨保护素体外抑制小鼠单核巨噬细胞 成熟分化的实验研究

目的研究骨保护素（Osteoprotegerin, 0PG)抑制核因子NF-KB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)诱导小鼠单核细胞RAW264. 7成熟分化而导致的溶骨效 应。方法50 ng/mL RANKL诱导RAW264. 7细胞1 d后,加人100 ng/mL 0PG(实验组,即0PG + RANKL组）或不加人0PG(对照组,即RANKL组）分别培养7 d和9 d,经细胞形态学观察其变化,抗 酒石酸酸性碟酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞,扫描 电镜下观察在骨片上的破骨细胞所致的骨吸收陷窝形成情况。结果对照组培养7 d时,在倒置相 差显微镜、透射电镜、光镜下可见细胞形状为椭圆形或不规则形,胞体明显较KAW264.7细胞增大, 胞核多为6 ~ 10个,扫描电镜下还可见大量伪足形成,而实验组培养7 d后,细胞形状多为圆形,且扫 描电镜下未见明显伪足形成;对照组9 d时可见大量TRAP染色阳性的多核巨细胞（含3个或3个以 上的细胞核）,而实验组中TRAP染色阳性的多核破骨细胞偶见多核巨细胞,培养9 d时很难找到多 核巨细胞;仅用RANKL诱导RAW264.7细胞分化7 d时,对照组中破骨细胞表面可见大量伪足伸出, 并形成明显的骨吸收陷窝,实验组中破骨细胞见少许伪足突出,不能看到明显的骨陷窝形成。结论 单用50 ng/mL RANKL体外连续诱导RAWM4.7细胞7 d时,可以促进成熟的破骨细胞显著分化。 100 ng/mL 0PG培养9 d能有效地抑制破骨细胞的分化,减少破骨细胞的骨吸收效应。     

体外研究橙皮苷抑制钛颗粒介导的破骨细胞分化

目的研究橙皮苷对钛颗粒介导前破骨细胞分化及成熟的影响。 方法骨髓巨噬细胞在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)30 ng/ml及核因子κB受体活化因子配体(Rankl)50 ng/ml刺激下,诱导分化为破骨细胞。扫描电镜观察钛磨损颗粒形貌结构。对不同浓度下橙皮苷对巨噬细胞增殖的影响进行t检验分析得出最低有效浓度;对抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性细胞数及骨吸收陷窝面积判断橙皮苷对破骨细胞分化及成熟的影响。最后通过实时定量PCR(RT-PCR)验证橙皮苷对钛颗粒介导的破骨基因,包括活化T细胞核因子(NFATc1)、组织蛋白酶K (CTSK)、TRAP的影响。TRAP阳性细胞数及骨吸收陷窝面积、RT-PCR结果数据均采用t检验分析。 结果扫描电镜显示钛磨损颗粒大小在1～3 μm。CCK-8实验结果显示橙皮苷对巨噬细胞增殖有促进作用,浓度超过40 μmol/L后,会对巨噬细胞产生抑制作用(F＝40.1, P<0.01),所以选择40 μmol/L作为对巨噬细胞分化的影响。在抗酒石酸酸性磷酸酶染色中发现40 μmol/L的橙皮苷会明显抑制前破骨细胞的分化,TRAP阳性细胞数目及破骨细胞的面积明显减少(t＝5.5,P<0.05)。与对照组相比,扫描电镜观察钛颗粒介导骨吸收陷窝面积明显增多,但加入40 μmol/L的橙皮苷后,这种吸收效果或明显减少(t＝6.1,P<0.05)。最后,通过RT-PCR实验得出,40 μmol/L的橙皮苷会明显抑制破骨细胞分化相关NFATc1, CTSK,TRAP基因(t＝7.1、4.8、9.1,均为P<0.05)。 结论橙皮苷抑制钛颗粒介导的破骨细胞分化及成熟。     

低分子量褐藻糖胶对破骨细胞凋亡的影响

目的探讨低分子量褐藻糖胶(LMWF)对小鼠单核细胞RAW264.7诱导成熟破骨细胞凋亡的影响。方法通过100ng/m L RANKL诱导RAW264.7细胞株分化为破骨细胞,经TRAP特异性染色和骨吸收陷窝对诱导后的细胞进行鉴定。鉴定成功后,用100 ng/m L RANKL诱导RAW264.7细胞株5 d后,使用含有LMWF的培养基继续培养3 d,通过对TRAP阳性细胞计数和分析骨吸收面积来观察低分子量褐藻糖胶对破骨细胞的抑制和骨吸收功能情况;采用流式细胞术检测LMWF对破骨细胞凋亡的影响,capsase-3活性测试试剂盒检测LMWF对capsase-3活性进行测定;RT-PCR检测LMWF对成熟破骨细胞BAX与BCL-2基因表达的影响。结果单纯采用100 ng/m L的RANKL可成功诱导成熟的、有功能的破骨细胞。LMWF可以明显抑制RANKL诱导成熟破骨细胞的形成以及成熟破骨细胞的骨吸收功能;流式细胞术显示LMWF可增加成熟破骨细胞的早期凋亡率;并且能升高capsase-3的活性;PCR显示LMWF可明显下调破骨细胞凋亡相关的BCL-2和上调BAX基因mRNA表达,降低BCL-2/BAX的比值。结论低分子量褐藻糖胶可抑制破骨细胞的活性与骨吸收能力,促进破骨细胞凋亡,其主要机制是通过下调BCL-2和上调BAX mRNA基因表达实现的。     

Ipriflavone inhibits osteoclast differentiation in parathyroid transplanted parietal bone of rats

Summary Ipriflavone, a synthetic isoflavone-derived flavonoid, was shown to have inhibitory effect on bone resorption. In order to study its mechanism of action directly on bone, 46 female Wistar rats were divided into six groups and medicated orally for 25 days as follows: groups 1 and 2 were given 1% carboxymethylcellulose solution (vehicle), groups 3, 4, 5, and 6 were administered ipriflavone at doses of 0.178, 0.356, 0.712, and 1.424 mmol/kg/day (suspended in vehicle), respectively. On the 22nd day, parathyroid glands, taken from donor rats, were transplanted in contact with the outer surface of the periosteum of both the right and the left parietal bones of rats from groups 2, 3, 4, 5, and 6. The group 1 rats underwent sham operation. Bone histomorphometry, performed on the ectocranial periosteum of parietal bones, showed that absolute erosion boundary, absolute eroded area, absolute erosion depth, number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)-positive polinucleated osteoclasts, and number of TRAP-positive mononucleated cells decreased in ipriflavone-treated rats compared with group 2 rats. The reduction was roughly proportional to the increase of drug dosage and reached statistical significance in rats of groups 5 and 6. The same parameters were extremely low in group 1 rats. Mineral apposition rate did not differ in any of the groups. Significant increase of serum calcium and significant decrease of serum phosphate were found in group 2 rats compared with group 1 rats, whereas no differences from controls were detected in ipriflavone-treated animals.The results demonstrate that ipriflavone has a direct inhibitory effect upon bone resorption, probably by reducing recruitment or differentiation of osteoclasts, rather than by inhibiting the resorption activity of differentiated osteoclasts. Ipriflavone also seems to exert a protective action against parathyroid hormone (PTH) diffusion from the site of parathyroid gland transplantation.     

自噬在破骨细胞中的调控作用及机制

破骨细胞(osteoclast,OC)是由单核巨噬细胞增殖分化而来的一类具有骨吸收功能的多核细胞,其生成过多及异常活化可诱发如骨质疏松、骨关节炎等多种骨代谢性疾病。自噬作为真核细胞中高度保守的分解代谢过程,在维持细胞稳态、应激损伤修复以及增殖分化中发挥着重要作用。近年来研究发现,自噬同样参与调控OC的生成和骨吸收功能。一方面,自噬在OC中可被多种因素诱导激活,如营养不足、低氧、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)、炎症因素、磨损颗粒、微重力环境等等,不同诱导因素如RANKL、炎症因素和磨损颗粒之间可相互联系,共同发挥作用;另一方面,激活后的自噬参与调节OC分化成熟的各个阶段,自噬可促进OC的增殖并抑制凋亡、促进OC的分化、迁移和骨吸收功能。由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)介导的经典自噬信号通路是目前研究的热点,其上游可被磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase...     

破骨细胞分化因子胞外区的克隆表达与纯化

目的　破骨细胞分化因子的克隆 ,重组蛋白的表达及纯化。方法　自 1g死胎肝组织中提取总RNA ,反转录cDNA后作为模板 ,设计上下游引物 ,多聚酶链反应 (PCR)扩增出目的片段。将PCR产物克隆至组氨酸标签的融合蛋白表达载体 pProEXTM HTc ,并送测序。在异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导下 ,可以稳定表达出破骨细胞分化因子胞外区蛋白 ,用镍离子交换柱纯化该蛋白。结果　逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR )扩增出特异的目的条带 ,75 0bp大小。测序结果完全正确。诱导后可以表达重组蛋白 ,相对分子质量为 3 2× 10 3 。结论　RT PCR可以简便的扩增目的基因。重组破骨细胞分化因子蛋白可以通过大肠杆菌原核表达载体诱导表达得到。     

Inhibitory and stimulatory effects of prostaglandins on osteoclast differentiation

The effect of prostaglandins (PGs) on osteoclast differentiation, an important point of control for bone resorption, is poorly understood. After an initial differentiation phase that lasts at least 4 days, murine monocytes, cocultured with UMR106 osteoblastic cells (in the presence of 1,25-dihydroxyvitamin D₃) give rise to tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) positive osteoclast-like cells that are capable of lacunar bone resorption. PGE₂ strongly inhibits TRAP expression and bone resorption in these cocultures. To examine further the cellular mechanisms associated with this inhibitory effect, we added PGE₂ to monocyte/UMR106 cocultures at specific times before, during, and after this initial 4-day differentiation period. To determine whether this PGE₂ inhibition was dependent on the type of stromal cell supporting osteoclast differentiation, we also added PGE₂ to cocultures of monocytes with ST2 preadipocytic cells. Inhibition of bone resorption was greatly reduced when the addition of PGE₂ to monocyte/UMR106 cocultures was delayed until the fourth day of incubation; when delayed until the seventh day, inhibition did not occur. PGE₂ inhibition of bone resorption was concentration-dependent and at 10⁻⁶ M was also mediated by PGE₁ and PGF_2α. In contrast to its effects on monocyte/UMR106 cocultures, PGE₂ stimulated bone resorption in monocyte/ST2 cocultures. Both ST2 cells and UMR106 cells were shown to express functional receptors for PGE₂. These results show that PGs strongly influence the differentiation of osteoclast precursors and that this effect is dependent not only on the type and dose of PG administered, but also on the nature of the bone-derived stromal cell supporting this process. Received: 12 October 1995 / Accepted: 1 April 1996