天花粉蛋白突变体TCSRL28-29CG的构建、表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行N i-NTA层析纯化。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSRL28-29CG,并获得高效表达。     

天花粉蛋白突变体TCSFYY163-165CSA的构建表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并在原核系统进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇(FYY163-165),并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot法鉴定和Ni-NTA层析纯化。结果:构建了带有TCS突变体基因(TCSFYY163-165CSA)的重组表达质粒,使目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSFYY163-165CSA,并获得高效表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。     

重组天花粉蛋白的原核表达纯化和免疫原性分析

目的构建携带天花粉蛋白基因的高效表达载体,对比原核表达的重组天花粉蛋白和天然蛋白的免疫原性.方法通过RT-PCR技术扩增无N端和C端序列的TCS基因,测序鉴定后克隆入表达载体pET-29b中,IPTG诱导表达.用金属螯合层析法纯化重组蛋白.薄层扫描及Bradford法检测纯化后重组蛋白的纯度和含量.间接ELISA法检测重组蛋白和天然蛋白产生的多克隆抗体效价.Western blotting检测重组蛋白与抗天然蛋白抗体之间的免疫反应性.结果 1.双酶切鉴定结果表明,pET-29b-TCS成功构建;2.30℃,1 mmol/L的IPTG诱导4 h,重组蛋白的表达量最高（占细菌总蛋白量的36%）,主要以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中;3.His-tag特异性结合树脂纯化后,获得了纯度达95%的重组蛋白,纯化后的蛋白含量为1.2 g/L;4.间接ELISA法检测天然蛋白和重组蛋白产生的抗体效价分别为1：4 960和1：5 120;5.Western blotting测纯化的重组蛋白与抗天然蛋白的多克隆抗体之间有特异反应性.结论本实验成功构建了高效表达载体pET-29b-TCS,携带的天花粉蛋白基因无N端和C端编码序列.重组蛋白的抗体效价显著低于天然蛋白,表明天然蛋白的糖基化与其免疫原性之间有一定的关系.     

天花粉蛋白对人艾滋病毒的作用及其临床试验

天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是从葫芦科植物栝楼[Trichosanthes kirilowiiMaxim(Cucurbitaceae)]球根中提取的一种碱性蛋白。从三世纪起,我国一直用作引产药物,近几十年的研究还表明对葡萄胎,恶性葡萄胎和宫外孕有独特的疗效,对绒癌也有一定疗效。十分有趣的是,McGrath等最近发现,TCS在体外可抑制人艾滋病毒HIV的增殖,有些方面优于被美国食品和药品管理局批准的第一个临床用艾滋病治疗药物叠氮胸苷(AZT),引起世界关注。本文仅就抗艾滋病的研究概况作一简要介绍。一、天花粉蛋白的主要理化性质和生物学功能     

天花粉蛋白裂解片段的纯化及鉴定

本文采用等电聚焦制备电泳仪(Rotofor cell)纯化经溴化氰裂解的天花粉蛋白片段,经SDS-PAGE及氨基酸成份分析加以鉴定。结果提示,所获电泳纯的两个天花粉蛋白片段分别含有28个氨基酸及52个氨基酸,为从天花粉蛋白一级结构水平了解结构和功能之间的关系提供重要的实验材料。     

应用单抗分析结晶天花粉蛋白的抗原决定簇

本文报道用制备的22株单克隆抗体为探针,采用ELISA双抗体相加试验以分析结晶天花粉蛋白上抗原决定簇的结果。经集群分析法处理,可将22株单抗集群为不同的六组。由此提示,结晶天花粉蛋白上有六个不同的、可被单抗识别的抗原决定簇。此数目与我们对结晶天花粉蛋白上B细胞识别的抗原决定簇进行计算预测所得到的结果相吻合。这对于从分子水平进一步探讨结晶天花粉蛋白结构与功能之间的关系奠定了基础。     

抗CEA单抗-天花粉蛋白偶联物的研制及活性鉴定

应用SPDP化学偶联法,将天花粉蛋白通过二硫键交联与抗CEA单抗制备成免疫毒素,经Sepbadex G-150凝胶过滤和Blue Sepharose-4B离子梯度交换层析纯化,电泳鉴定显示这一免疫毒素纯度高,偶联蛋白克分子比合理。应用间接免疫荧光染色技术和ELISA法测定结果证明,其与CEA人结肠癌细胞(LoVo)具有特异结合反应,仍保留大部份原抗体活性。具有较好的导向性。体外毒性试验结果表明,免疫毒素对靶细胞(LoVo)有选择性的杀伤作用,50％细胞毒剂量(I.C50)为10~(-9)范围,比单用天花粉蛋白和天花粉蛋白与正常小鼠IgG-偶联物对靶细胞杀伤能力分别增强约150倍和2000倍,而对实验对照细胞(Hela)杀伤无增强作用。     

抗天花粉蛋白单抗用于天花粉蛋白免疫毒素的亲和纯化

天花粉蛋白（ＴＣＳ）是一种单链致核糖体失活的蛋白，用细胞融合技术筛选到一株分泌抗该蛋白单抗的杂交瘤细胞株（Ｔ１Ａ９），并将单抗Ｔ１Ａ９制成免疫亲和凝胶，用此亲和凝胶纯化以ＴＣＳ和抗人黑色素瘤单抗Ｎｇ７６构建的免疫毒素，能有效地分离掉样品中的游离抗体，提高免疫毒素的毒效。体外细胞毒性实验表明，亲和纯化的免疫毒素对黑色素瘤细胞（Ｍ２１）的杀伤作用比分子筛（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００）层析后的样品提高了６．３倍。它对Ｍ２１细胞的半致死浓度（ＩＣ＿（５０））为１．０×１０￣（－１０）ｍｏｌ／Ｌ。比ＴＣＳ和Ｎｇ７６的混合物的毒性（ＩＣ＿（５０）＝２．５×１０￣（－７）ｍｏｌ／Ｌ）提高了２５００倍。ＴＣＳ是制备免疫毒素的一种有效和常用的“弹头”，用此法纯化这类免疫毒素将会有一定的普遍性。     

天花粉蛋白诱发人体免疫抑制的遗传控制：Ⅱ.群体研究及调控机理分析

根据CD8阳性细胞在天花粉蛋白作用下是否表达抑制功能,将68名随机正常人区分为21名CD8介导型个体(M~ )和47名非介导型个体(M~-),介导系数均值分别为13.4和-5.6。根据群体中介导系数变异的双峰性分布,推断M~ 和M~-所显示的免疫学特征属于单基因控制的遗传性状,相应等位基因频率分别为0.1686和0.8314。由于M~-在天花粉蛋白作用下不显示CD8细胞参与的免疫低反应性,该类个体免疫应答强度应高于M~ ,经测定,两者相对反应值相差12.5～12.7%。根据M~-人群去除CD8细胞后免疫抑制加剧这一现象,进一步提出上述基因可能发挥作用于反抑制水平。     

汉滩病毒结构蛋白昆虫细胞融合表达产物的免疫原性评价

目的：研究汉滩病毒（HTNV）囊膜糖蛋白G1与核蛋白（NP）部分片段在昆虫细胞中融合表达产物的免疫学特性，为HTNV基因工程疫苗的研制提供依据。方法：构建含有HTNV G1S0.7嵌合基因的重组杆状病毒Bac-G1S0.7，用其感染的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠。用间接免疫荧光法、ELISA法、微量细胞培养中和试验及T淋巴细胞增殖试验对被免疫小鼠的体液免疫及细胞免疫应答效果进行检测。结果：Bac-G1S0.7感染的昆虫细胞免疫小鼠后，测得免疫鼠血清抗HTNV抗体滴度最高达1：3200，含有特异性抗HTNV NP及抗HTNV糖蛋白G1的抗体，被免疫小鼠中有部分产生了较低滴度的中和抗体，免疫鼠脾细胞对HTNVNP或糖蛋白的增殖反应指数均高于阴性对照组。结论：G1S.07嵌合基因的昆虫细胞表达产物具有较好的免疫原性，可刺激机体同时产生针对HTNV NP与囊膜糖蛋白G1的细胞及体液免疫应答。     

HPV主要壳蛋白L1的B细胞共同表位短肽免疫原性的研究

人乳头瘤病毒 (humanpapillomavirus ,HPV)是一类无包膜的环状小DNA病毒 ,可引起广泛的人类上皮细胞的增殖性病变。为了有效预防这类病毒的感染和传播 ,世界各国都在开展大量HPV基因工程疫苗的研究。广泛研究证实 ,HPV主要壳蛋白L1和次要壳蛋白L2存在中和表位。L1具备在单独表达体系中自行装配、形成病毒样颗粒 ,在一定程度上能够替代天然病毒 ,诱导产生针对天然病毒的保护性抗体。但是L1蛋白分子量较大 ,表达成本高 ,且型特异性强 ,以任意一型HPVL1免疫动物 ,很难诱导出针对多型的免疫反应。因此 ,必须寻找到HPVL1的共同表位 ,以…     

His-tag 不影响 RSV 重组蛋白GIF/M2 的免疫原性

目的:观察 His-tag 是否影响 RSV 重组蛋白 GIF/M2 的免疫原性.方法:PCR 扩增 G1 和 F/M2 基因片段,插入表达载体 pET-His 和 pET-DsbA-His 中,转化E.coli BL21(DE3),IPrG 诱导表达,采用 Ni+螯合亲和层析法纯化得 His-GlF/M2 和 DsbA-His-GIF/M2,将后者用凝血酶消化,再经Ni+螯合亲和层析法纯化得 GIF/M2,将 His-GIF/M2 和 GIF/M2 免疫 BALB/c 小鼠,用 ELISSA 测定抗体滴度,MTT 法测定细胞毒性 T 细胞活性(CTL).结果:两种蛋白在BALB/ c 小鼠中诱导的 RSV 特异性抗体和 CTL 活性无显著差异.结论:His-tag 不影响 RSV 重组蛋白GIF/M2 的免疫原性.     

天花粉蛋白抑制抗CD3mAb诱导的淋巴细胞内PKCα激活

利用免疫印迹技术和蛋白激酶自身磷酸化方法,研究了天花粉蛋白（Tk）对在淋巴细胞信号传导中起重要作用的PKC的影响。天花粉蛋白脉冲处理过的PBMC,其经由抗CD3mAb诱导的PKCα的活化转位情况受阻, PKC自身磷酸化也被遏制,表明Tk能够抑制PBMC中PKCα的激活。研究结果提示Tk诱发人体免疫低反应至少部分是通过抑制淋巴细胞内PKC激活而实现的。     

天花粉蛋白对T淋巴细胞功能的调节作用

天花粉蛋白是从中药天花粉中提取纯化的一种活性蛋白,具有引产、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性。近年来的研究发现,天花粉蛋白对免疫系统具有调节作用。本文从细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡三个方面就其对T淋巴细胞功能的调节作用作一综述。     

缺失半胱氨酸富集区的HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的高效表达及免疫原性分析

目的 删除人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1) HXB2株Tat蛋白(长度101个氨基酸)的半胱氨酸富集区(22～37位氨基酸)以提高其在大肠杆菌中的表达量和分子稳定性,并分析缺失半胱氨酸富集区后的Tat蛋白[Tat(△C)蛋白]免疫原性的改变.方法 应用PCR方法对Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸)进行缺失突变,获得其突变体序列[Tat(△C)DNA] ,并构建其重组表达质粒pET-32a-Tat(△C).相同的条件下将pET-32a-Tat(△C)和pET-32a-Tat质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化.用pET-32a-Tat(△C)融合蛋白免疫家兔制备抗血清,ELISA和Western blot方法对抗血清进行免疫原性分析.结果 pET-32a-Tat(△C)蛋白在大肠杆菌中的表达水平(7.12 mg/ml)明显高于pET-32a-Tat蛋白(1.50 mg/ml);pET-32a-Tat蛋白在表达纯化后及25℃和4℃放置7 d后均有明显二聚体的产生,而pET-32a-Tat(△C)蛋白则未形成二聚体;pET-32a-Tat(△C)蛋白免疫家兔可诱导产生高滴度的抗体(1∶320 000),该抗体与Tat(△C)蛋白、Tat蛋白(1～101 AA)及化学合成Tat(1～86 AA)蛋白均呈特异性反应.结论 缺失HIV-1 Tat蛋白的半胱氨酸富集区可明显提高其原核表达水平和蛋白的稳定性并较好地保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗研究提供了一种新型免疫原.     

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白CD4结合位点修饰诱导小鼠体液免疫反应的实验研究

目的 探讨Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)包膜糖蛋白(Env) gp120的CD4结合位点(CD4BS)核心区第423、425和431位氨基酸三联突变ING/MKE对其诱导体液免疫反应的影响.方法 构建HIV-1原代毒株06044包膜gp120 ING/MKE三联突变表达载体pcT22-06044 gp120T-ING/MKE(gp120T-ING/MKE),在体外转染的HEK293T细胞表达三聚化野生型gp120Twt蛋白和突变体gp120T-ING/MKE蛋白.免疫BALB/c小鼠后检测结合抗体、中和抗体和骨髓抗原特异性浆细胞.结果 获得真核表达载体gp120T-ING/MKE.转染后,在293T细胞培养上清中检测到了三聚化重组蛋白.末次免疫后14 d,gp120Twt和gp120T-ING/MKE免疫血清中结合抗体滴度都大于1∶1 000,但两组血清抗体滴度无显著差异.突变体组骨髓特异性浆细胞分泌水平和非特异浆细胞水平均低于野生型gp120免疫组.野生型和突变体免疫诱导血清抗体的中和活性均不强.结论 HIV-1包膜蛋白CD4结合区423、425和431位三联突变没有改善gp120蛋白的免疫原性.     

天花粉蛋白对T细胞活化的抑制作用与信号传导

目的观察天花粉蛋白经由ＴＣＲ／ＣＤ３介导的信号传递途径抑制Ｔ细胞活化增殖的效应。方法用各种不同的剌激信号来激活外周血淋巴细胞，然后观察天花粉蛋白对其增殖抑制的影响。接着测定天花粉蛋白对ＣＤ３单抗剌激后Ｔ淋巴细胞内一些信号传导物质变化的影响。结果天花粉蛋白抑制经由ＴＣＲ／ＣＤ３信号传导途径诱发的淋巴细胞增殖。进而发现细胞内游离钙离子的升高，蛋白激酶Ｃ的转位和细胞内蛋白酪氨酸磷酸化受天花粉蛋白的抑制。结论天花粉蛋白可通过ＴＣＲ／ＣＤ３的信号传导途径抑制Ｔ细胞增殖。